大鼠50%減體積肝移植技術(shù)的改進(jìn)

1、PAGE PAGE 7 大鼠50%減體積肝移植技術(shù)的改進(jìn)何勇1,2 姜驪1,2 魚達(dá)1,2 謝海洋1,2 鄭樹森1,2（1， 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2， 浙江省器官移植重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室 ， 杭州 310003 ）【摘要】目的 建立改良的大鼠50%減體積原位肝移植的模型。方法 在經(jīng)典的雙袖套法大鼠肝移植模型的基礎(chǔ)上，通過4次貫通穿刺、3次結(jié)扎、2次回折的肝臟縫扎方法，改善肝臟減體積切取的效果。結(jié)果 所有50%減體積原位肝移植的大鼠均存活良好，肝功能迅速恢復(fù)正常，達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)動(dòng)物模型的要求。結(jié)論 采用本實(shí)驗(yàn)室規(guī)范的4貫通、3結(jié)扎、2回折的肝臟縫扎方法，可以建

2、立穩(wěn)定的50%大鼠同種異體減體積原位肝臟移植模型，值得推廣應(yīng)用。【關(guān)鍵詞】大鼠；減體積肝移植；動(dòng)物模型The process optimization 0f 50% reduced-size liver transplantation in ratsYong He1,2, Li Jiang1,2, Da Yu1,2, Haiyang Xie1,2, Shusen Zheng1,21, Key Laboratory of Multi-Organ Transplantation, Ministry of Health；First Affiliated Hospital, Zhejiang Univ

3、ersity School of Medicine, Hangzhou 310003, China.2, Key Laboratory of Organ Transplantation in Zhejiang province, Hangzhou 310003, China.【Abstract】 Objective To investigate the methodological improvement and process optimization of 50% reduced-size liver orthotopic transplantation model in rats.Met

4、hods Base on the classical double-bushing model, establish new process to improve the effect of liver resection, with the method of penetrated puncture 4 rounds, ligate 3 times and 2 folds back to graft the 50% reduced-size donor liver orthotopically. Results All rats remain good conditions after op

5、eration, liver function keep back to normal level quickly. Conclusions With the surgical novel graft method, a stable 50% reduced-size orthotopic liver transplantation model could be established，it meet the requirement of design of experiment of animal model，and is worth promoting.【Key words】 Rat; R

6、educed-size liver transplantation; Animal model 基金項(xiàng)目“浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”項(xiàng)目（NO.2009R50038）作者簡(jiǎn)介何勇（1984 ），男，主要研究方向：小動(dòng)物器官移植。E-mail: 通訊作者魚達(dá)（1946 ），男，主要研究方向：器官移植，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。E-mail: dayu46在對(duì)大鼠肝臟再生的研究1中，減體積的處理技術(shù)規(guī)范是十分重要的。 在研究的過程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)，是研究課題重要的直接參與和組成部分。大鼠全肝移植，在一些肝臟移植著作2,3和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的論文4,5 中已有論述。在50%大鼠肝臟移植的操作技術(shù)上，不同的課題研究人員，可以采

7、用不同的方法。不同方法的技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)不易評(píng)價(jià)，本文推薦我們的方法，認(rèn)為值得應(yīng)用推廣。 1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠80 只，81O周齡，體重200220g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033。本研究進(jìn)行了40對(duì)大鼠的同種異體原位50減體積肝移植手術(shù)。其中， 40只用于提供50體積的供肝，40只為受體大鼠。每對(duì)供、受體大鼠體重相差15g，一般取供體大鼠的體重略小于受體?？傮w研究中1、3、5、7天分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組（group）分為2小組（part1，part2），動(dòng)物分2批購置，每小組有50%減體積肝移植大鼠5只，由同一操作者，分2個(gè)階

8、段完成，見表1 。1.2 術(shù)前準(zhǔn)備和麻醉動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，新到的大鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3天以上。供體術(shù)前不禁食水，受體術(shù)前禁食12h，不禁水。麻醉： 供、受體均采用4%的水合氯醛0.6-0.7 ml/100g 腹腔注射麻醉。在麻醉前15 min，每只大鼠肌肉注射阿托品0.04 mg。1.3 供體手術(shù)供體大鼠麻醉、脫毛、常規(guī)消毒，取正中切口。游離、切斷肝周圍韌帶，縫扎左膈下靜脈；剪開尾狀葉前方腹膜，游離尾狀葉。距左、右肝管匯合處以下5 mm處切開膽總管前壁，插入膽管支架約2 mm結(jié)扎固定后切斷膽總管遠(yuǎn)端。游離肝下下腔靜脈和右腎靜脈，并結(jié)扎。供肝50%減體積（將在下一節(jié)中介紹）后肝素化，再

9、在腹主動(dòng)脈穿刺置管，對(duì)肝臟進(jìn)行灌注，分離結(jié)扎切斷幽門靜脈、脾靜脈和胃十二指腸靜脈,縫扎肝固有動(dòng)脈，遠(yuǎn)肝端切斷，供肝取下，置于04生理鹽水浴中。1.4 供肝的處理1.4.1 供肝的50%減體積本研究通過多次的預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用 4次貫通穿刺、3次結(jié)扎和2回折的肝臟縫扎方法。具體為：整個(gè)縫扎過程使用帶針的6-0 Prolene縫線，從操作者的右側(cè)向左側(cè)依次進(jìn)行。在需要切除的肝葉的右側(cè)1/3處從肝臟的臟面向膈面進(jìn)針，貫通肝臟（1貫通）從右側(cè)繞至進(jìn)針點(diǎn)處打結(jié)（1結(jié)扎），保留縫線；向右側(cè)折回（1回折），在第1針結(jié)扎肝的中間從膈面向臟面進(jìn)針貫通肝臟（2貫通），再從另一面的臟面的左側(cè)1/3處進(jìn)針，貫通肝臟（3貫通

10、）與保留的縫線打結(jié)（2結(jié)扎）；向右側(cè)折回（2回折），在第2針結(jié)扎肝的中間從膈面向臟面進(jìn)針，貫通肝臟（4貫通）與保留的縫線在肝左側(cè)膈面打結(jié)（3結(jié)扎）。其中，每次結(jié)扎都要收緊，但要避免縫線將肝組織切斷，確實(shí)使結(jié)扎縫線環(huán)繞、阻斷肝組織中的血管。本肝臟縫扎方法簡(jiǎn)稱：4貫通、3結(jié)扎、2回折法，見示意圖1、圖2。由于做多環(huán)繞扣式縫扎，保留肝臟周邊的變形皺折較少，見圖3、圖4。1.4.2供肝血管修整及套袖和支架的安裝套袖自制，制作規(guī)格同Kamada，門靜脈套管外徑2.20 mm，內(nèi)徑1.80 mm，肝下下腔靜脈套袖外徑2.80 mm，內(nèi)徑2.50 mm自制袖管做成。所有修整安裝過程均在冷生理鹽水浴中操作。大

11、鼠50%供肝的門靜脈和下腔靜脈套袖安裝和膽管支架安置方法與全肝移植相同，見圖5 。1.5 受體手術(shù)受體自身肝臟切除與供體基本相同。完全游離右腎靜脈水平以上的肝下下腔靜脈，無損傷止血夾于右腎靜脈上阻斷肝下下腔靜脈和斷門靜脈主干遠(yuǎn)端，此時(shí)受體鼠進(jìn)入無肝期。經(jīng)門靜脈左右分支分叉處注入生理鹽水2ml,用無損傷止血鉗連同部分膈肌一起鉗夾肝上下腔靜脈，切除受體鼠自身的肝臟。將供肝從冷生理鹽水浴中取出，原位置入受體腹腔。供肝外包裹4鹽水紗布，擺正供肝的位置，用預(yù)置8-0縫線連續(xù)端端縫合肝上下腔靜脈。在最后一針收口前用生理鹽水沖洗管腔排盡氣體。吻合管口沖洗排氣將門靜脈袖套插入受體門靜脈腔內(nèi)，環(huán)扎固定。松開門靜

12、脈和肝上下腔靜脈的阻斷鉗，結(jié)束無肝期。可見肝臟迅速充盈并恢復(fù)正常顏色。同法連接肝下下腔靜脈。將供肝的膽道支架管插入受體的膽總管內(nèi)固定后，外用大網(wǎng)膜包繞。所有管道吻合連接完畢后，可見位于受體大鼠的腹腔內(nèi)的50%肝臟體積明顯小于全肝，圖6 。1.6 術(shù)后處理術(shù)后大鼠置于鼠籠內(nèi)，單籠飼養(yǎng)，以普通照明燈提升動(dòng)物體表溫度，以便術(shù)后盡快復(fù)溫，直至大鼠活動(dòng)自如。動(dòng)物蘇醒后立即提供飲水和飼料，一般術(shù)后2小時(shí)起恢復(fù)飲水，6小時(shí)左右可恢復(fù)自主進(jìn)食。1.7 結(jié)果的表達(dá) 本文的結(jié)果從技術(shù)技能的角度，主要采用圖解和解說；對(duì)肝功能數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的方法6表達(dá)。2 結(jié)果本實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分為2小組，分2個(gè)階

13、段，由同一操作者完成50%減體積原位肝移植。大鼠減體積肝移植與全肝移植相比較，在手術(shù)所花費(fèi)的時(shí)間上有10分鐘的延長(zhǎng)，供肝的肝臟套袖、受體肝臟吻合等步驟沒有不同。研究的結(jié)果的全部?jī)?nèi)容已有發(fā)表1。現(xiàn)將谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和膽紅素（TBIL）的資料顯示如下，見表1。在術(shù)后1-7天內(nèi)，50%肝臟移植后的大鼠肝功能ALT、AST明顯下降，向?qū)φ战M的數(shù)值靠近，TBIL值與對(duì)照組逐漸相同。大鼠50%肝臟移植完成，植入肝色澤良好，結(jié)果見圖3 。表1 手術(shù)組和對(duì)照組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和膽紅素（TBIL）比較*Tab. 1 The data of ALT，AST an

14、d TBIL compared with the time by surgery and control group肝功能Liver function實(shí)驗(yàn)天數(shù) 組Days group ALT ( U/L )AST( U/L)TBIL( mol/L)(對(duì)照)(control)50%移植50% livergraft (對(duì)照)(control) 50%移植50% livergraft(對(duì)照)(control)50%移植50% livergraft1 daygrouppart 1(66.86.7)345.8 76.9(133.888.7)579.2118.1(3.601.14)3.830.98part

15、 2371.5100.4590.4120.93.830.763 daygrouppart 168.014.2165.243.13.671.63part 2105.278.3199.2142.83.671.515 daygrouppart 181.69.7149.264.13.601.52part 280.239.7170.884.03.801.107 daygroupgroup 186.69.6155.624.83.601.14part 292.69.0180.231.63.600.55* 結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的均數(shù)和平均差的方法進(jìn)行歸納。隨著術(shù)后天數(shù)的延長(zhǎng)，50%肝臟移植大鼠的ALT、AST明顯下

16、降，向?qū)φ盏臄?shù)值靠近，TBIL值與對(duì)照組逐漸相同。* The results are summarized by the method of statistics of the mean and the mean difference. During the period of postoperative day, 50% of liver transplantation in the rat of ALT and AST decreased obviously to the same level of controlled group gradually; TBIL value is as

17、the same as the control group. 3 討論國內(nèi)夏穗生教授的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)大鼠減體積肝移植有很好的研究2。其中他們的肝左側(cè)葉的結(jié)扎切除方法是：看清肝中葉靜脈和左側(cè)葉肝靜脈的匯合處，在其外側(cè)洞穿左側(cè)葉根部，帶入2根1-0絲線，分別向左側(cè)葉上下兩緣結(jié)扎，再剪下左側(cè)葉。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，減體積肝移植組近期并發(fā)癥和主要死亡原因是肝臟切割面出血。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在肝臟結(jié)扎的時(shí)候最好是保持留用肝周邊的自然張力，縫線不宜收得太緊。本研究采用相對(duì)較細(xì)的縫線，做多環(huán)繞扣式縫扎，將結(jié)扎的力分散，在肝葉切除后保留肝的變形較少。在一些預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上形成了我們的“4貫通、3結(jié)扎、2回折的肝臟縫扎方法”

18、。減體積肝移植手術(shù)由于手術(shù)過程中肝臟結(jié)扎邊緣肝細(xì)胞的損傷，加之缺氧和肝臟缺血再灌損傷，必然不同程度地導(dǎo)致肝臟轉(zhuǎn)氨酶類的釋放，所以在肝細(xì)胞數(shù)量較少的情況下，最大限度地盡快恢復(fù)肝細(xì)胞功能是有益的選擇。本方法對(duì)于從全肝移植技術(shù)熟練的人員轉(zhuǎn)向50%肝臟移植，可能產(chǎn)生的出血、膽道并發(fā)癥等技術(shù)問題不多，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）在術(shù)后3天開始迅速恢復(fù)，表明本研究使用的肝臟縫扎方法有動(dòng)物恢復(fù)快的優(yōu)點(diǎn)。這一技術(shù)在本單位對(duì)胸腺素T3加速肝臟再生1和促進(jìn)肝臟缺血性損傷的恢復(fù)的研究中得到了應(yīng)用7。由于正常SD大鼠的ALT、AST和TBIL的正常范圍，在有關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物書籍和論文中尚無參考值，本文主實(shí)驗(yàn)

19、1需要觀察指標(biāo)的設(shè)計(jì)時(shí)間較短，經(jīng)對(duì)有關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)6的學(xué)習(xí)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的“整體架構(gòu)”中，認(rèn)為用數(shù)據(jù)表格描述法，表達(dá)ALT、AST和TBIL比較合適。50%大鼠肝臟移植的生化指標(biāo)，即便是同一操作者，由于動(dòng)物的批次不同，以及實(shí)驗(yàn)外環(huán)境的細(xì)微差別等，也會(huì)產(chǎn)生一定的差異。不同的技術(shù)操作，由于操作人員的不同，是本文所提的“方法的技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)不易評(píng)價(jià)”的原因。就本實(shí)驗(yàn)室而言，該方法已成為我們大鼠減體積肝臟移植的技術(shù)規(guī)范，認(rèn)為值得應(yīng)用推廣。 圖1 肝臟左外葉縫扎示意圖 圖2 肝臟左中葉縫扎示意圖Fig.1 Diagram of left liver lobe suture Fig.2 Diagram of liver

20、 left middle lobe suture 圖3 去除尾狀葉和左外葉后的供肝 圖4 去除尾狀葉、左外葉和左中葉后的供肝Fig.3 The liver after removal of Fig.4 The liver after removal of caudatecaudate lobe and left lobe lobe , left lobe and the left middle lobe 圖5 供肝的套袖和支架安裝完畢 圖6 移植完成Fig.5 Cuff and stand Installed Fig.6 50% liver transplantion completed 參考文獻(xiàn)：1 Ahmed Taki-Eidin，Lin Zhou，Hai-yang Xie，et alTri-iodothyronine enhances liver regeneration after living donor liver transplantation in ratsJJ Hepatobiliary ancrea