合成肽S247-預(yù)先給藥對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的影響

1、合成肽S247預(yù)先給藥對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的影響作者單位：430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，武漢 430022桂平 武慶平 姚尚龍【摘要】 目的 研究合成肽S247預(yù)先給藥對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（VILI）的影響及其機(jī)制。方法 24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組（n=8），對(duì)照組（C組）：不進(jìn)行機(jī)械通氣；高潮氣量組（H組）：潮氣量40ml/kg，呼氣末正壓0 cmH2O ，呼吸頻率40次/min，吸入氧濃度21；S247預(yù)先給藥組（S組）：腹腔注射S247 100mg.kg-1.d-1 1次/d，持續(xù)2周，在最后一次注射30

2、min后開始機(jī)械通氣，機(jī)械通氣的參數(shù)設(shè)定同H組。C組和H組在相同的時(shí)間點(diǎn)注射等量的生理鹽水。機(jī)械通氣4h后放血處死大鼠，取肺組織，光鏡下觀察肺病理變化，測(cè)定肺濕/干重比（W/D），免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長因子-1（TGF-1）的表達(dá)；收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），測(cè)定總蛋白（TP）含量、腫瘤壞死因子（TNF-）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白2（MIP-2）的濃度，并進(jìn)行白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)。 結(jié)果 與C組比較，H組和S組W/D、WBC計(jì)數(shù)、TP含量和TGF-1的表達(dá)升高（P0.01），H組MIP-2的濃度升高(P0.01)并且肺組織病理學(xué)改變嚴(yán)重；與H組比較，S組W/D、WBC計(jì)數(shù)、TP含量、TNF-和M

3、IP-2濃度和TGF-1的表達(dá)降低(P0.01或0.05)，肺組織病理學(xué)改變明顯減輕。結(jié)論 S247預(yù)先給藥可減輕大鼠VILI，其機(jī)制與抑制了TGF-1的激活有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】 呼吸窘迫綜合征，成人；呼吸，人工；轉(zhuǎn)化生長因子-1Effect of synthesized peptide S247 pretreatment on ventilator-induced lung injury in rats WU Qing-ping Department of Anesthesiology , Union Hospital , Tongji Medical College , Huangzhong

4、University of Science and Technology , Wuhan 430022 , China【Abstract】 Objective To investigate the effect of synthesized peptide S247 pretreatment on ventilator-induced lung injury(VILI) and its possible mechanism . Methods Twenty four male SD rats weighing 250-313g were randomly divided into 3 grou

5、p(n=8 each) : control group(group C): no mechanical ventilation; high tidal volume group(group H): 40ml/kg tidal volume , 0 cmH2O of positive end-expiratory pressure , 40 breaths/min and FiO2=0.21; S247 pretreatment group(group S): Rats in group S received intraperitoneal injection of S247 one time

6、every day(100mg.kg-1.d-1) and the treatment lasted for two weeks . Mechanical ventilation started 30min after the last injection and mechanical ventilation settings were the same as group H .Rats in group C and group H were injected with equal volume of normal saline at the same time . The animals w

7、ere sacrificed by exsanguination at the end of 4h mechanical ventilation . The lungs were removed for (1) microscopic examination , measuring wet-to-dry weight ratios(W/D) and determination of transforming growth factor-1(TGF-1) expression , and (2) broncho-alveolar lavage and determination of total

8、 protein(TP) contents , TNF- and MIP-2 concentrations and WBC counts in broncho-alveolar lavage fluid(BALF) . Results Group H showed serious histopathologic damage and the damage of group S was less pronounced . W/D , WBC counts , TP contents and TGF-1 expression in group H and group S and MIP-2 con

9、centration in group H were significantly higher than in group C(P0.01). W/D , WBC counts , TP contents , concentrations of TNF- and MIP-2 and TGF-1 expression in group S were significantly lower than in group H(P0.01 or 0.05). Conclusion Pretreatment with S247 can significantly inhibit the activatio

10、n of TGF-1 and attenuate VILI in rats.【Key words】 Respiratory distress syndrome , adult; Respiration , artificial; Transforming growth factor-1機(jī)械通氣是臨床救治呼吸功能嚴(yán)重受損病人一種必不可少的治療手段，但使肺受到了過度的機(jī)械牽拉。過度的機(jī)械牽拉會(huì)破壞肺的結(jié)構(gòu)，影響氣體交換和激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（VILI）的發(fā)生。其重要的組織病理學(xué)特點(diǎn)為水腫，白細(xì)胞滲出和肺泡毛細(xì)血管膜的破壞1。轉(zhuǎn)化生長因子-1（TGF-1）在體外能增加肺上皮細(xì)胞的通透

11、性，在體內(nèi)藥物性抑制TGF-1可以顯著減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠肺損傷時(shí)肺水腫程度2。S247是一種人工合成的小分子多肽，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制TGF-1的激活。S247是否能減輕VILI尚需要進(jìn)一步探討。本研究擬觀察S247預(yù)先給藥對(duì)大鼠VILI的影響，為臨床研究提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 動(dòng)物及分組：清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體重250313g，隨機(jī)分為三組，每組8只。對(duì)照組（C組），高潮氣量組（H組）和S247預(yù)先給藥組（S組）。S組大鼠腹腔注射S247 100mg.kg-1.d-1 1次/d，持續(xù)2周，在最后一次注射30min后開始機(jī)械通氣。C組和H組大鼠在相同的時(shí)間點(diǎn)注射等量的生理鹽水

12、。粉末狀的S247（上海英駿生物技術(shù)有限公司）注射前用生理鹽水稀釋成20mg/ml。1.2 VILI動(dòng)物模型的制備：H組和S組的大鼠腹腔注射20的烏拉坦1.3g/kg麻醉，利用額鏡，直視下經(jīng)口插入氣管導(dǎo)管（用16號(hào)靜脈套管針代替），口腔填塞細(xì)紗布條以防止漏氣，連接到683型小動(dòng)物容量控制呼吸機(jī)（Harvard Apparatus公司，美國）行機(jī)械通氣，潮氣量40ml/kg，呼吸頻率40次/min，呼氣末正壓0 cmH2O，吸入氧濃度21，通氣時(shí)間為4h。股靜脈置管，乳酸鈉林格氏液以3ml/h的速度持續(xù)靜脈輸注。頸動(dòng)脈置管，1205A監(jiān)測(cè)儀（hp公司，美國）監(jiān)測(cè)心率和平均動(dòng)脈壓。通氣過程中動(dòng)物保

13、持仰臥位，通氣結(jié)束后頸動(dòng)脈放血處死。C組大鼠不進(jìn)行機(jī)械通氣。1.3 標(biāo)本制備：機(jī)械通氣后4h，放血處死大鼠。小心分離左右兩側(cè)肺組織，結(jié)扎右主支氣管，4生理鹽水4ml分兩次注入氣管，輕輕回抽，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），低溫離心（1200g，4，10min），上清液等分后-70保存，用于測(cè)定總蛋白（TP）含量、腫瘤壞死因子（TNF-）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白2（MIP-2）的濃度，沉淀物用于白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)。分離右肺上葉用于測(cè)定肺濕/干重比（W/D）。分離右肺中葉，4多聚甲醛固定，用于觀察肺組織病理學(xué)改變和免疫組化檢測(cè)TGF-1的表達(dá)。1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法：（1）W/D：右肺上葉稱重后，置

14、于70的烤箱烘烤直至恒重，計(jì)算W/D。（2） BALF WBC計(jì)數(shù)：BALF離心沉淀物用PBS稀釋后光鏡下行WBC計(jì)數(shù)（3）BALF TP含量：用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（Pierce公司，美國）按說明書進(jìn)行操作。（4）BALF TNF-和MIP-2濃度：用ELISA試劑盒（Biosource公司，美國）按說明書進(jìn)行操作。（5）肺組織病理學(xué)改變：右肺中葉石臘包埋，切片，一部分切片HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。（6）肺組織TGF-1表達(dá)：另一部分切片用于免疫組化法檢測(cè)肺組織TGF-1表達(dá)，兔抗大鼠TGF-1多克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒為武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品，按試劑盒說明操作，DA

15、B染色，陽性染色為胞漿染成棕黃或棕褐色。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（200），圖象采用HMIAS-2000型全自動(dòng)彩色圖像分析系統(tǒng)（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院圖象分析室）進(jìn)行蛋白半定量分析，以光密度反映TGF-1蛋白含量。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 病理學(xué)改變：C組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰；H組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡腔內(nèi)出血、滲出物和間質(zhì)水腫明顯；S組肺泡結(jié)構(gòu)尚存，肺泡間隔有一定程度的增寬，肺泡腔內(nèi)出血和滲出物較H組明顯減輕。2.2 W/D

16、，BALF WBC計(jì)數(shù)、TP含量、TNF-和MIP-2濃度：與C組比較，H組和S組W/D、WBC計(jì)數(shù)、TP含量升高，H組MIP-2的濃度升高（P0.01），與H組比較，S組W/D、WBC計(jì)數(shù)、TP含量、TNF-和MIP-2濃度降低（P0.01或0.05），見表1。表 1 三組W/D、WBC 計(jì)數(shù)、TP含量和細(xì)胞因子濃度的比較（n=8 , ）組別W/DWBC(/ml)TP(g/l)TNF-(pg/ml)MIP-2(pg/ml)C組4.430.111 7802481.20.3-538H組5.370.09*19 9671 894*9.60.7*1311310419*S組4.600.10*#12 35

17、02 475*#7.10.6*#11114688#與C組比較，*P0.01 與H組比較，#P0.01 P0.052.3 肺組織TGF-1表達(dá)：C組肺泡上皮呈弱陽性染色，H組肺泡上皮呈強(qiáng)陽性染色，S組肺泡上皮染色明顯減弱，見圖1。C組，H組和S組的光密度值分別為：0.1020.012，0.3010.015和0.1560.010。與C組比較，H組和S組TGF-1表達(dá)升高（P0.01）；與H組比較，S組TGF-1表達(dá)降低（P0.01）。圖 1 三組肺組織TGF-1的免疫組化檢測(cè)（DAB染色，200）3 討論VILI是機(jī)械通氣嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其組織病理學(xué)特征為水腫，白細(xì)胞滲出和肺泡毛細(xì)血管膜的破壞。

18、本研究采用高潮氣量機(jī)械通氣建立VILI大鼠模型參考了王月蘭等的研究3，H組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡腔內(nèi)出血、滲出物和間質(zhì)水腫明顯，W/D、BALF WBC計(jì)數(shù)、TP含量、TNF-和MIP-2濃度都顯著高于C組，表明VILI模型建立成功。本研究發(fā)現(xiàn)H組肺上皮細(xì)細(xì)胞TGF-1的表達(dá)較之對(duì)照組顯著增加。有研究表明LPS、TNF-、IL-1和IL-8并不能使肺上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）表達(dá)TGF-1增加4，但氧自由基和H2O2能顯著增加其表達(dá)，這與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的激活有關(guān)5，6。VILI時(shí)肺泡腔大量的WBC聚集，WBC氧化酶（NADPH氧化酶）使還原型輔酶（NADPH）氧化而產(chǎn)生超氧陰離子，后者經(jīng)自發(fā)性

19、歧化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，這可能是VILI時(shí)肺上皮細(xì)細(xì)胞TGF-1表達(dá)顯著增加的原因。S組BALF WBC計(jì)數(shù)介于C組和H組之間，故S組肺上皮細(xì)細(xì)胞TGF-1的表達(dá)水平也介于兩者之間。TGF-1在體外可以通過衰竭肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)的谷胱苷肽而增加其通透性，在體內(nèi)藥物性抑制TGF-1可以顯著減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷時(shí)肺水腫程度2。TGF-1要發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，首先需要被激活。肺上皮細(xì)胞整合素v6和v8能結(jié)合到TGF-1前體相關(guān)肽的精氨酸甘氨酸天冬氨酸（RGD）位點(diǎn)通過兩種不同的方式將其激活7，8。S247是一種人工合成的含RGD序列的小分子多肽，它是v整合素的非特異性阻斷劑，能與細(xì)胞外基質(zhì)中含RGD序

20、列的整合素配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于該類整合素9。S247預(yù)先給藥能競(jìng)爭(zhēng)性抑制TGF-1的激活，減輕VILI時(shí)肺上皮細(xì)胞的通透性和肺水腫的程度，所以S組肺病理學(xué)改變顯著輕于H組，W/D、BALF WBC計(jì)數(shù)、TP含量、TNF-和MIP-2濃度顯著低于H組。S247并不直接減少肺上皮細(xì)胞TGF-1的表達(dá)，S組TGF-1表達(dá)較H組減少是肺泡上皮細(xì)胞通透性降低后BALF WBC計(jì)數(shù)下降的結(jié)果。S組的損傷并不能降到C組的水平，這一方面可能是由于S247預(yù)先給藥量不是防治VILI的最適劑量，另一方面可能是由于VILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，S247只是干預(yù)了其中部分機(jī)制。綜上所述，S247預(yù)先給藥能減輕大鼠VILI,其機(jī)制

21、與抑制了TGF-1的激活有關(guān)。參考文獻(xiàn)1 BELPERIO JA , KEANE MP , LYNCH JP 3RD , et al . The role of cytokines during the pathogenesis of ventilator-associated and ventilator-induced lung injuryJ . Semin Respir Crit Care Med , 2006 , 27(4):350-364 .2 PITTET JF , GRIFFITHS MJ , GEISER T , et al . TGF-beta is a critical

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