病原微生物設計性實驗

1、對猩紅熱病原菌的研究研究內容摘要目的：初步設計實驗對猩紅熱病原菌進行分離培養(yǎng)鑒定，研究其藥敏實驗，了解對該病的 預防及治療。方法：從咽拭子獲取并分離培養(yǎng)得純種病原菌，通過直接涂片鏡檢、觸酶試驗、膽汁溶菌試驗、糖發(fā)酵試驗、桿菌肽敏感試驗、鏈激酶試驗、PYR式驗等進行鑒別，最后進行藥敏試驗分析。結果：觸酶試驗、膽汁溶菌試驗、糖發(fā)酵試驗陰性；桿菌肽敏感試驗、鏈激酶試驗、PYR試驗陽性。結論：猩紅熱的病原菌是A組B型溶血性鏈球菌。關鍵詞：猩紅熱；A組B型溶血性鏈球菌；小兒；分離鑒定；藥敏試驗一、選題的目的和意義猩紅熱是由A組B型溶血性鏈球菌引起的急性呼吸道傳染病，屬于乙類傳染病，臨床特 征主要為發(fā)熱、

2、咽峽炎、全身彌漫性鮮紅色皮疹、疹后脫屑等，且病后可出現(xiàn)變態(tài)反應性心、 腎、關節(jié)并發(fā)癥，對人體危害十分嚴重。該病一年四季都有發(fā)生，尤其以冬春之季發(fā)病為多。 猩紅熱發(fā)病多見于小兒，且以 28歲兒童居多，因此極易在幼兒園及小學中傳播流行。在這 些范圍內一旦有病例發(fā)生流行，將嚴重影響正常的教學秩序及生活秩序，極易引發(fā)較大的社 會影響。因此對猩紅熱的研究是十分有必要的。通過研究，我們希望了解猩紅熱的癥狀與類型、病原學特點、臨床診斷、并發(fā)癥及治療 方法等，進而能初步設計實驗對該病原菌進行分離培養(yǎng)鑒定，同時研究并掌握其致病力及藥 敏實驗，了解該病的預防措施及治療方法，希望對以后的臨床實踐有所幫助。由于猩紅熱

3、更 易在冬春季節(jié)且在幼兒、兒童中傳播，因此針對該病的研究可以幫助我們設計并實施有效的 防護措施對其進行積極的預防和控制，如及時隔離患者并進行有效治療，講究室內衛(wèi)生和注 意通風等。同時，對猩紅熱病原學的研究可以讓我們更好的做到精確診斷、對癥下藥、正確 治療、及時解除患者病痛。因此，我們小組選擇了這個課題，并認真分工合作，查找資料進 行研究，完成了此次報告。二、國內研究現(xiàn)狀A 組 B 型溶血性鏈球菌（beta . haemolytic group A Streptococcus isolates , GAS區(qū) 稱為釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）,是一種常見的致病性化膿性

4、革蘭陽性球菌，經(jīng) 常侵犯上呼吸道黏膜上皮表皮等淺表部位，引起咽扁桃體炎、猩紅熱、肺炎及膿皰病等疾?。?少數(shù)情況下可致壞死性筋膜炎、敗血癥、鏈球菌中毒性休克綜合征等及患者生命的侵襲性疾 病；遲發(fā)性GASS染后非化膿性疾病，如急性風濕熱及鏈球菌感染后腎小球腎炎等也很常見。 近年來嚴重侵襲性GASS染在歐美一些國家再次增多，人類開始重新關注GASS染問題。2）。GAS的外毒素包括紅疹毒素和細胞溶解毒素（鏈球菌溶血素s和0）,紅疹毒素除了與各種免 疫反應及細胞反應有關外，還能通過增強機體對鏈球菌各種產(chǎn)物的超敏反應引起致熱反應及 皮膚紅斑反應。猩紅熱分三型：普通型，在流行期間 95%患者屬于此型，近年來

5、癥狀更見輕微，大部分患者僅有低熱、輕度咽痛，皮疹稀少，極不典型且消退快、脫屑也少，但仍可發(fā)生變態(tài)反 應的。腎小球腎炎及風濕性關節(jié)炎； 中毒型，以毒血癥為主要表現(xiàn)如高熱，劇烈頭痛，繁 嘔吐，神志不清，1、2天內可發(fā)生中毒性心肌炎和感染性休克，皮疹顯著迅速遍布全身，呈 暗紅色或出血性，休克時皮疹常不明顯，應及時救治；膿毒型，咽部癥狀明顯，滲出物多 有假膜、水月中，病原菌擴散形成化膿性病變或進入血中全身播散引起膿毒血癥，此時病死率 高；外科型包括產(chǎn)科型，多為外傷感染。 今年猩紅熱患者較多，隨著生化指標檢測范圍的擴大，發(fā)現(xiàn)猩紅熱熱患者肝功能變化明 顯，筆者認為猩紅熱患者細菌感染后，各器官細胞受損，引起

6、血清 eOALY AST,ALR LD十L、 TB邵增高，另一方面各種抗生素的大劑量使用，勿必導致肝細胞損壞，各種酶潘陛增加，而 且猩紅熱癥狀消失后，各種酶仍持續(xù)異常一段時間，提示臨床治療猩紅熱的同時監(jiān)測肝功能 是必要的，必要時保肝治療 。猩紅熱的耐藥問題也需重視，導致我國兒童發(fā)生猩紅熱的GAS寸大環(huán)內酯類抗生素及四環(huán)素 呈現(xiàn)高水平耐藥和高耐藥率；臺灣學者認為猩紅熱發(fā)病率的變化與菌株的毒力因子、環(huán)境因 素及抗生素的使用等多種因素有關(6,7) o(1)楊永弘，沈敘莊.重視 A族鏈球菌和相關兒科疾病的研究J .臨床兒科雜志.2006, 24(6) : 443_444.(2)LiangY , Sh

7、en X, Huang G et al . Characteristicsof Strepto COCClpyogenesstrains isolated from Chinesechildren with scarletfeverJ. Acta Paediatr , 2008, 97(12) : 1 68l-1 685Jing HB, Ning BA, Hao HJ, et a1. Epidemiologicalanalysis ofgroup A streptococci recovered from patientsin ChinaJ . J.Med Microbiol , 2006。5

8、5(Pt 8) : 1 101 一 l 107 .張志宇 張義強110006遼寧沈陽市第六人民醫(yī)院 021 122內蒙呼倫貝爾市大雁醫(yī)院有限公司doi : 10. 3969/j . issn . 1007 614x, 2010l8 , 082當代醫(yī)學 2010年 9fl 第 16卷第 26期總第 217期Contemporary Medicine , Sep. 2010, Vo1. 16 No. 26 Issue No. 217doi ：10. 3969/j . issn . 1009 4393 . 2010. 26. 078Brenciani A , Baceiaglia A , Veeeh

9、i M , et a1 . Genetic Elements Carrying erm(B)in Streptococcus pyogenes and Association withtet(M)Tetracycline Resistance GeneJ. Antimierob AgentsChcmother , 2007, 5l(4) : 1 209 1216.(7 ) Koh EH, Kim S , Lee NY. Decrease of erythromycin resistance in group A streptococci by change of cmm distributio

10、nJ . Jpn J Infect Dis 2008, 61(4) : 261-263 .三、擬采取的技術路線及實驗方案技術路線：咽拭子平板劃線法*分離培養(yǎng)血瓊脂平板 肉湯血清純化增菌鑒定方法革觸膽鏈桿PYR糖蘭酶汁激菌實發(fā)氏實溶酶肽驗酵染驗菌實敏實色實驗感驗驗實驗藥敏試驗實驗方案：1、病原菌的分離培養(yǎng)分離純種的病原菌【方法】37 c孵育24小時將咽拭直接接種在血瓊脂平板，采用平板劃線法，劃線完畢后，蓋好平板, 后，觀察并挑選單個菌落接種。純化增殖病原菌【方法】取典型菌落接種于另一血瓊脂平板，接種完畢后，37c孵育24小時，觀察分離的單個菌落的形態(tài)、大小、顏色、邊緣、光滑度、透明度、濕潤度、溶

11、血情況等。取典型菌落接種于液體培養(yǎng)基，接種完畢后，37c孵育24小時，觀察生長狀況，注意生長數(shù)量、渾濁度、有無表面及沉淀生長。2、病原菌的鑒定直接涂片鏡檢【方法】取病原菌直接涂片進行革蘭染色，鏡檢觀察細菌的染色性、大小、形態(tài)、排列，進行初步診斷。觸酶試驗【材料】試劑3 %過氧化氫溶液【方法】取潔凈玻片一張，中央劃線分離，滴加過氧化氫一滴，取病原菌于其中磨勻，約30秒后觀察有無氣泡出現(xiàn)，有氣泡出現(xiàn)為陽性，無氣泡出現(xiàn)為陰性。用生理鹽水作對照，從而判斷觸酶試 驗陰陽性。膽汁溶菌試驗【材料】試劑10 %去氧膽酸鈉溶液【方法】取病原菌液加入試管中，再加入10 %去氧膽酸鈉溶液，搖勻后置 37c水浴103

12、0min,試管 內溶液變清為陽性，試管內溶液仍渾濁為陰性。用生理鹽水作對照，從而判斷膽汁溶菌試驗陰 陽性。桿菌肽敏感試驗【材料】桿菌肽紙片【方法】取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用滅菌銀子夾取每片含有0.04單位的桿菌肽紙片置于上述平板上，36c培養(yǎng)18-24h,如有抑菌圈出現(xiàn)即為陽性。用已知的陽性菌株做對照，從而判 斷桿菌肽敏感試驗陰陽性。鏈激酶試驗【材料】試劑草酸鉀血漿、0.25%氯化鈣0.25mL【方法】吸取草酸鉀血漿0.2mL,加0.8mL滅菌生理鹽水，混勻，再加入病原菌肉湯培養(yǎng)物0.5mL及0.25% 氯化鈣0.25mL,混勻，置于36c水浴10min,血漿混合物自行凝固，觀察凝塊重

13、新完全溶解的 時間，完全溶解為陽性，如24h后不溶解即為陰性。用已知的陽性菌株作對照，從而判斷鏈激 酶實驗陰陽性。糖發(fā)酵試驗【材料】培養(yǎng)基 菊糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管一支【方法】將病原菌接種于菊糖糖管中，37c培養(yǎng)1824小時，觀察結果，如指示劑變黃，小管內有氣 泡形成為產(chǎn)酸產(chǎn)氣，無氣泡形成為只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，指示劑無變化為不分解。PYR實驗【方法】L-叱咯酮B紊胺反應實驗，通過反應產(chǎn)物和試劑產(chǎn)生的產(chǎn)物顯色或呈現(xiàn)熒光而快速診斷。3、病原菌的藥敏試驗【方法】即抗生素敏感試驗。按瓊脂擴散法進行。挑取 45個純化菌落制備菌懸液，濃度為0. 5麥氏單 位，用無菌棉拭子沾取該菌液，均勻涂布于 MH血平板上，待干后，

14、于每塊平板貼23張藥敏 紙片，24h培養(yǎng)后，用卡尺測抑菌圈直徑。十種抗生素分別是慶大霉素、青霉素 G頭抱睡咻、 環(huán)丙沙星、頭抱嚷匹、苯口坐青霉素、去甲萬古霉素、氨葦青霉素、紅霉素及頭抱三嗪。四、預期結果1、病原菌的分離培養(yǎng)分離純種的病原菌劃線平板中形成大量的單個細小菌落。純化增殖病原菌血瓊脂平板上形成較多的灰白色、表面光滑、濕潤、 邊緣整齊、直徑0.50.75mm的細小菌落。菌落周圍形成一個24mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環(huán)。菌落在血清肉湯管底呈絮狀沉淀。2、病原菌的鑒定直接涂片鏡檢細菌為球形或橢圓形，直徑 0.61.0um。呈鏈狀排列，長短不一。無芽抱，無鞭毛。培養(yǎng) 早期形成透明質酸的莢膜，隨著培養(yǎng)時間的延長，莢膜消失。初步診斷為鏈球菌屬。觸酶試驗原理：含有觸酶的細菌能催化過氧化酶，放出生態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。若不含有，則無氣泡產(chǎn)生。結果：30秒后無氣泡產(chǎn)生，根據(jù)生理鹽水對照組可判斷為觸酶陰性。膽汁溶菌試驗原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，不溶解 A群鏈球菌，可作為鑒別依據(jù)。結果：試管內菌液仍較渾濁，未變澄清。因此為膽汁溶菌試驗陰性。據(jù)此可以得出此病原 菌不是肺炎鏈球菌。桿菌肽敏感試驗原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎全部敏感，而其他群鏈球菌絕大多數(shù)對其耐藥。結果：培養(yǎng)1824h,出現(xiàn)抑菌環(huán)，根據(jù)陽性菌株對照可判斷，為陽性。初步診斷為 A群溶 血性鏈球菌。鏈