動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)技術(shù)課件 高中生物競賽

1、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)技術(shù)一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)概述（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的概念 指在人工條件（除滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)要求外，還要進(jìn)行pH和溶解氧的最佳控制）下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scale culture technology） 人工條件下，動(dòng)物細(xì)胞在反應(yīng)器中進(jìn)行大量地、高密度培養(yǎng)，以生產(chǎn)珍貴生物制品的技術(shù)。 pH溫度溶氧發(fā)酵工藝等條件發(fā)展簡史1907 Harrison創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)技術(shù)； 1951 Earle開發(fā)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)合成培養(yǎng)基；1957 Graff應(yīng)用灌注技術(shù)，培養(yǎng)密度達(dá)1010個(gè)

2、/L；1962 Capstick成功實(shí)現(xiàn)小鼠腎細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，標(biāo)志著動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的開始；1967 Van Wezel成功地以DEAE-Sephadex A50為載體，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的載體培養(yǎng)；1975 Kohler和Milstein成功建立單克隆抗體技術(shù)；1975 Sato用激素代替血清使垂體細(xì)胞株在無血清介質(zhì)中生長成功，預(yù)示無血清培養(yǎng)的誘人前景；1986 Deme Biotech公司首次成功地用微囊化技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞來生產(chǎn)單克隆抗體；1989 Konstantinovti首次提出大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過程中的生理狀態(tài)控制技術(shù)，更新培養(yǎng)工藝的優(yōu)化控制理論。發(fā)展簡史動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用

3、 疫苗生產(chǎn)上的應(yīng)用 已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品有口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、骨髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、牛白血病疫苗 干擾素生產(chǎn)上的應(yīng)用 自1957年發(fā)現(xiàn)干擾素以來，經(jīng)歷了自然干擾素、基因重組干擾素和蛋白質(zhì)工程干擾素等3個(gè)發(fā)展階段。英國Wellcome公司為了滿足臨床實(shí)驗(yàn)的需要，采用8000L Namalwa細(xì)胞生產(chǎn)干擾素。 DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級(jí)放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口收獲病毒Vero細(xì)胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝單克隆抗體生產(chǎn)上的應(yīng)用 應(yīng)用動(dòng)植物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體是一條經(jīng)濟(jì)、可靠的途徑。 英國Celltech公

4、司采用無血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體；國內(nèi)也已成功地應(yīng)用中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體作為血型定型試劑。 其他基因重組產(chǎn)品生產(chǎn)上的應(yīng)用 細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工較大或更復(fù)雜的克隆蛋白質(zhì)；可以簡化蛋白質(zhì)的分離提純；美國Endotronic公司用中空纖維生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生長激素等。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一般工藝流程1 組織塊；2組織塊碎片；3消化；4離心；5原代培養(yǎng)；6傳代培養(yǎng)；7液氮罐保存細(xì)胞；8復(fù)蘇培養(yǎng)；9擴(kuò)大培養(yǎng)；10大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 根據(jù)動(dòng)物細(xì)

5、胞的培養(yǎng)特性不同，可采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng) 指細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮生長增殖的培養(yǎng)方法。 主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞。貼壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧效果比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可以借鑒許多細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。懸浮培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 不能采用灌流培養(yǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞密度較低，另外只有少數(shù)細(xì)胞適合懸浮培養(yǎng)。攪拌式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器2、貼壁培養(yǎng) 指細(xì)胞貼

6、附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 目前為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細(xì)胞工廠和微載體等。其中微載體培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過濾系統(tǒng)；同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例、適用于所有類型細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大，占地面積大；不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長。3 2 旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)14 中空纖維培養(yǎng) 細(xì)胞工廠培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)目前為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細(xì)胞工廠和微載體等。兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)（1）旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 細(xì)

7、胞貼附在轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋轉(zhuǎn)而流動(dòng)，細(xì)胞交替接觸營養(yǎng)和空氣，利于細(xì)胞吸收營養(yǎng)、進(jìn)行氣體交換。細(xì)胞在體內(nèi)、體外的生存空間：存在差異三維空間，高密度生長二維空間，單層生長，生長密度低體內(nèi)體外（2）中空纖維培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng)技術(shù)模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細(xì)血管”即中空纖維來為細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件。 中空纖維是細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，水分子、小分子營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以通過。管壁表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞能在上面貼壁生長。 細(xì)胞接種到中空纖維的外表面，而充氧的培養(yǎng)液灌流到中空纖維的內(nèi)腔。貼附在外表面的細(xì)胞吸取內(nèi)腔滲出的營養(yǎng)，迅速生長繁殖。一段時(shí)間后細(xì)胞占據(jù)

8、中空纖維外壁所有空間，并在纖維表面堆積。（3）細(xì)胞工廠培養(yǎng)由一組長方形培養(yǎng)小室組成。(a)向培養(yǎng)室內(nèi)灌注培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在各培養(yǎng)小室之間流動(dòng) ；(b)細(xì)胞工廠轉(zhuǎn)動(dòng)90。，每個(gè)培養(yǎng)小室液體被分隔，氣相仍到達(dá)各個(gè)培養(yǎng)小室；(c)向下放平，封閉入口，或者連接到5CO2通氣管上（4）微載體培養(yǎng)微載體（Microcarrier）：是直徑60-250m的適用于貼壁依賴型細(xì)胞生長的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。良好微載體的特點(diǎn)：1、好的生物相容性：無毒無害；2、好的黏附性：適于細(xì)胞附著、伸展和增殖，一般帶正電荷；3、大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一； 4、良好的傳質(zhì)性能；5、強(qiáng)的機(jī)械性能：

9、保護(hù)細(xì)胞、重復(fù)利用；6、好的熱穩(wěn)定性：適合高壓蒸汽滅菌。微載體培養(yǎng)的操作過程： 微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞也經(jīng)過以上四步。大致可以分為五個(gè)階段，即培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、維持培養(yǎng)階段、細(xì)胞收獲階段、微載體培養(yǎng)的放大階段。培養(yǎng)初期階段：保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的p和溫度，對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種至1/3體積的培養(yǎng)基中。黏附貼壁階段：緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。維持培養(yǎng)階段：隨細(xì)胞增殖，微球變重，增加攪拌速率。經(jīng)過3天左右，培養(yǎng)液呈酸性，需換液。細(xì)胞收獲階段：排干培養(yǎng)液，緩沖液漂洗1次，加入酶，快速攪拌，解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)的放大階段：增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行

10、放大。微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：1、表面積體積大 ，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高。2、把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合， 兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)。3、可用簡單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長情況。4、培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小；勞動(dòng)強(qiáng)度?。环糯笕菀?，使大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞成為可能。5、接種與收獲方便，可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，培養(yǎng)基利用率較高。微載體培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 細(xì)胞生長在微載體表面，培養(yǎng)過程中連續(xù)攪拌會(huì)損傷微載體表面的細(xì)胞，而且培養(yǎng)后期細(xì)胞容易從微載體上脫落下來。 為克服傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的不足，現(xiàn)開發(fā)出大孔微載體。大孔微載體內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，細(xì)胞在其內(nèi)部生長，保證細(xì)胞充分的生長空間，使細(xì)胞免受機(jī)械損傷，增加細(xì)胞貼壁的

11、穩(wěn)定性。3、固定化培養(yǎng) 將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來再進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 具有細(xì)胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易與產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附培養(yǎng)法、包埋培養(yǎng)法和微囊培養(yǎng)法。三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器類型滿足：低剪切力、良好的混合狀態(tài)、合適氧濃度、等。 20世紀(jì)70年代以來，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器有了很大的發(fā)展，種類越來越多，規(guī)模越來越大。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器類型 懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)反應(yīng)器包埋培養(yǎng)反應(yīng)器攪拌反應(yīng)器攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）流化床反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器玻璃珠床反應(yīng)器固定床反應(yīng)器中空纖維反應(yīng)器

12、中空纖維反應(yīng)器陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器1、攪拌罐式生物反應(yīng)器 與傳統(tǒng)的微生物反應(yīng)器相類似，只是根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性，作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的剪切力小，混合性能好，同時(shí)通氣培養(yǎng)過程中盡量減小操作對(duì)細(xì)胞的損傷程度而又能達(dá)到充足供氧的目的。 2、氣升式生物反應(yīng)器 自1979年Katinger等首次用氣升式生物反應(yīng)器成功地進(jìn)行了動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)以來，氣升式生物反應(yīng)器在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用一直是生物工程學(xué)家關(guān)注和熱衷的焦點(diǎn)。 3、中空纖維生物反應(yīng)器 中空纖維生物反應(yīng)器是個(gè)特制的圓筒，圓筒里面封裝著數(shù)千根中空纖維。纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，類

13、似于動(dòng)物組織內(nèi)的毛細(xì)血管，中空纖維的外徑一般為100500um，管壁厚度約5075um，管壁是極薄的半透膜，似海綿，富含毛細(xì)管。在中空纖維生物反應(yīng)器中就形成了兩個(gè)空間：一是“內(nèi)室”，即纖維管內(nèi)空間，可灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長；二是“外室”，即纖維管與管之間的間隙；細(xì)胞接種到外室，細(xì)胞貼附在外室的管壁上，并迅速吸取從內(nèi)室滲透出來的養(yǎng)分，迅速生長繁殖。 中空纖維反應(yīng)器具有無剪切力和高傳質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。 中空纖維生物反應(yīng)器的總體發(fā)展趨勢(shì)是讓細(xì)胞在管束外空間生長，以達(dá)到更高的培養(yǎng)細(xì)胞密度。中空纖維材質(zhì)可以是纖維素、改性纖維素、醋酸纖維、聚丙烯、聚砜、銅氨人造纖維、聚甲基丙烯酸甲酯及其他聚合物。 大規(guī)模HE

14、K293細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng) 重組腺病毒的純化 實(shí)時(shí)HPLC質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)四、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的操作方式1、分批式培養(yǎng)2、流加式培養(yǎng) 3、半連續(xù)式培養(yǎng)4、連續(xù)式培養(yǎng) 5、灌注式培養(yǎng)1、分批式培養(yǎng) 將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)，培養(yǎng)過程中體積不變，不添加其他成分，待細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。 2、流加式培養(yǎng) 將終體積1/31/2的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器中，適宜條件下接種細(xì)胞，培養(yǎng)過程中流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)液，使細(xì)胞持續(xù)生長至較高密度、目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高水平。 采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。 3、半連續(xù)式培養(yǎng) 也稱為重復(fù)批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間取出部分培養(yǎng)物，再用新培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，維持反應(yīng)器內(nèi)總體積不變。特點(diǎn)：（1）培養(yǎng)物的體積逐步增加； （2）可進(jìn)行多次收獲； （3）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，保持產(chǎn)物和細(xì)胞在較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)很長時(shí)間。4、連續(xù)式培養(yǎng) 將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積恒定。 細(xì)胞可在穩(wěn)定狀態(tài)下生長，環(huán)境條件如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH可恒定，可有效延長細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期。5、灌注式培養(yǎng) 細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增