食品化學(xué)第七章市公開課獲獎?wù)n件

1、第七章 細(xì)菌引起食源性疾病 第一節(jié) 致病性大腸埃希氏菌及其食物中毒大腸桿菌分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬， ATCC11775是該屬模式菌種普通包括五種：腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E.coli,EPEC）腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E.coli, EIEC）粘附性大腸桿菌（Enteroadhesive E.coli,EAEC）第1頁第1頁致病性大腸桿菌指那些能夠引起人、動物（尤其是嬰兒和幼齡動

2、物）感染及人食物中毒一類大腸桿菌，致病性和非致病性大腸桿菌能用血清學(xué)辦法從抗原結(jié)構(gòu)差別上進(jìn)行區(qū)別。一些血清型菌株致病性強(qiáng)，引起嬰兒腹瀉與人腸道內(nèi)外感染，一些血清型引起食物中毒，一些主要引起畜禽疾病，危害畜牧業(yè)。大腸桿菌分類也經(jīng)常以血清型進(jìn)行區(qū)別，如O：157 第2頁第2頁一、生物學(xué)特性（一）形態(tài)特性及培養(yǎng)特性 此菌為兩端鈍圓短小桿菌，普通大小為1.03.00.50.8m，革蘭氏染色陰性。有鞭毛、菌毛、莢膜等結(jié)構(gòu)。常見大腸桿菌生長在平板上菌落為白色濕潤光滑，打開平皿后，就有濃重惡臭味。 圖7-1 大腸桿菌電鏡照片第3頁第3頁（二）生化特性可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，絕大部分為脫

3、羧酶陽性M.R試驗陽性，吲哚試驗陽性V-P試驗陰性，不利用枸掾酸鹽不分解尿素不液化明膠不產(chǎn)H2S。第4頁第4頁（三）生長條件需氧或兼性厭氧菌，最適生長溫度為37，1545范圍內(nèi)均能生長，最適pH為7.27.4，若pH低于6.0或高于8.0則生長緩慢。 第5頁第5頁（四）抗原結(jié)構(gòu)主要有菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和莢膜（K）抗原三部分。O抗原 指光滑大腸桿菌菌體抗原，其構(gòu)成是細(xì)胞壁上糖、類脂、蛋白質(zhì)復(fù)合物，也是細(xì)菌內(nèi)毒素，對熱非常穩(wěn)定，經(jīng)高壓蒸汽處理2h而不被破壞。每一個血清型只含有一個O抗原，已分出167個血清型，分別以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。 H抗原 指鞭毛抗原，為蛋白質(zhì)構(gòu)成，一個大腸桿菌只有一個

4、H抗原。H抗原能被80熱處理或酒精破壞，共有 64種抗原。K抗原 指包于細(xì)胞外部莢膜物質(zhì)或包膜物質(zhì)表面抗原。新分離大腸桿菌70含有K抗原。依據(jù)K抗原對熱敏感性，可將K抗原分為A、B、L三類，當(dāng)前發(fā)覺100多個血清型，致病性大腸桿菌抗原主要為B抗原，少數(shù)為L抗原。B抗原與L抗原均可經(jīng)煮沸所破壞，L抗原還可被酒精和當(dāng)量鹽酸所破壞。 第6頁第6頁（五）抵抗力不耐熱，90度可殺死不耐冷，-25只能存活10個月左右 對化學(xué)藥物抵抗力較弱，如以5苯酚或1:500升汞處理，5min可殺死。對磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感。 第7頁第7頁（六）起源與分布在土壤、水、食品等處經(jīng)?？砂l(fā)覺 分布廣泛，“隨地可見”第8

5、頁第8頁二、中毒癥狀及原因 （一） 癥狀 一類是毒素型大腸埃希氏菌引起急性胃腸炎，主要癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉，糞便呈水樣，伴有粘液，無膿血，腹瀉次數(shù)每日可達(dá)510次，患者體溫升高，約為3840。 另一類為急性菌痢，主要癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、發(fā)熱，體溫可達(dá)37.840，連續(xù)34d，大便為伴有粘液膿血黃色水樣便。 第9頁第9頁（二）致病物質(zhì)1. 定居因子（Colonization factor ,CF）也稱粘附素(Adhesin)，即大腸桿菌菌毛。致病性大腸桿菌須先粘附于宿主腸壁，以免被腸蠕動和腸分泌液清除（以此做出發(fā)點(diǎn)能夠研究細(xì)菌定植問題）。使人類致瀉定居因子為CFA(Colonization f

6、actor antigen )，定居因子含有較強(qiáng)免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。第10頁第10頁第11頁第11頁2. 腸毒素：耐熱與不耐熱1不耐熱腸毒素（Heat labile enterotoxin， LT） 對熱不穩(wěn)定，65經(jīng)30min即失活。蛋白質(zhì)，分子量大，含有免疫原性。 由A、B兩個亞單位構(gòu)成，A又分成A1和A2，其中A1是毒素活性部分。B亞單位與小腸粘膜上皮細(xì)胞膜表面GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合后，A亞單位穿過細(xì)胞膜與腺苷酸環(huán)化酶作用，使胞內(nèi)ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。當(dāng)cAMP增長后，造成小腸液體過度分泌，超出腸道吸取能力而出現(xiàn)腹瀉。LT免疫原性與霍亂弧菌腸毒素相同，兩者抗血清有交叉中

7、和作用。第12頁第12頁 2耐熱腸毒素（Heat stable enterotoxin ,ST）：對熱穩(wěn)定，100經(jīng)20min仍不被破壞，分子量小，免疫原性弱。ST可激活小腸上皮細(xì)胞鳥苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)cGMP增長，在空腸部分改變液體運(yùn)轉(zhuǎn)，使腸腔積液而引起腹瀉。ST與霍亂毒素?zé)o共同抗原關(guān)系。產(chǎn)毒性大腸桿菌有些菌株只產(chǎn)生一個腸毒素，即LT或ST，有些則兩種均可產(chǎn)生，有些致病性大腸桿菌還可產(chǎn)生vero毒素。 第13頁第13頁三、典型疾病（一）腸道外感染 腸道外感染多為內(nèi)源性感染，以泌尿系感染為主，如尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎、上行性尿道感染多見于已婚婦女，也可引起腹膜炎、膽囊炎、闌尾炎等。嬰兒、年老

8、體弱、慢性消耗性疾病、大面積燒傷患者，大腸桿菌可侵入血流，引起敗血癥。早產(chǎn)兒，尤其是生后30d內(nèi)新生兒，易患大腸桿菌性腦膜炎。 第14頁第14頁（二）急性腹瀉（依據(jù)致病機(jī)理分5類）1. 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）2. 腸致病性大腸桿菌（EPEC） 3. 腸侵襲性大腸桿菌（EIEC） 4. 腸出血性大腸桿菌（EHEC） 5. 腸粘附性大腸桿菌（EAEC） 第15頁第15頁四、大腸桿菌檢測（一）血清學(xué)試驗 將分離大腸桿菌分別制備O抗原和K抗原，通過平板凝集試驗或試管凝集試驗進(jìn)行血清型鑒定。 第16頁第16頁（二）大腸桿菌O157H7研究O157H7致病因子及致病機(jī)理 O157H7檢測 康奈爾大學(xué)

9、Richard Durst 脂質(zhì)體檢測技術(shù)（見書本） 第17頁第17頁第二節(jié) 葡萄球菌及其引起胃腸炎 葡萄球菌屬（Staphylococcus）是一群革蘭氏陽性球菌，因常堆聚成葡萄串狀，故得名。多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可造成疾病 金黃色葡萄球菌（S.aureus） 表皮葡萄球菌（S.epedermidis） 腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）第18頁第18頁一、形態(tài)結(jié)構(gòu)球形或稍呈橢圓形，直徑0.41.2m，分裂面不規(guī)則，分裂后許多菌體無規(guī)則地堆積在一起，呈葡萄串狀。葡萄球菌無鞭毛，不能運(yùn)動。無芽孢，除少數(shù)菌株外普通不形成莢膜。革蘭氏染色為陽性，其衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬后一些菌株可被染

10、成革蘭氏陰性。 圖7-2 金黃色葡萄球菌電鏡照片第19頁第19頁二、培養(yǎng)與生理生化特性葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，在含有血液和葡萄糖培養(yǎng)基中生長更佳，需氧或兼性厭氧，少數(shù)專性厭氧。2838均能生長，致病菌最適溫度37，pH 4.59.8，最適為7.4。耐鹽性強(qiáng)，在含有10%15%氯化鈉培養(yǎng)基中能生長，在含有20%30%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，可產(chǎn)生大量毒素。在肉湯培養(yǎng)基中24h后呈均勻混濁生長，培養(yǎng)23d后可形成很薄菌環(huán)，在管底則形成多量粘稠沉淀。在瓊脂平板上形成圓形凸起，邊緣整潔，表面光滑，濕潤，不透明菌落。不同種菌株產(chǎn)生不同色素，如金黃色、白色、檸檬色。色素為脂溶性。葡萄球菌

11、在血瓊脂平板上形成菌落較大，有菌株菌落周圍形成顯著全透明溶血環(huán)（溶血），也有不發(fā)生溶血者，凡溶血性菌株大多含有致病性。 第20頁第20頁三、金黃色葡萄球菌引起胃腸炎金黃色葡萄球菌能引起食物中毒，主要原由于其能產(chǎn)生腸毒素（Enterotoxin， 簡稱SE） 從臨床分離金黃色葡萄球菌，約1/3產(chǎn)生腸毒素。腸毒素是一個可溶性蛋白質(zhì)，耐熱，經(jīng)100煮沸30min不被破壞，也不受胰蛋白酶影響，故誤食污染腸毒素食物后，在腸道作用于內(nèi)脂神經(jīng)受體，傳入中樞，刺激嘔吐中樞，引起嘔吐，并產(chǎn)生急性胃腸炎癥狀。發(fā)病急，病程短，恢復(fù)快。普通潛伏期為16h，出現(xiàn)頭暈、嘔吐、腹瀉，發(fā)病12d可自行恢復(fù)，預(yù)后良好。 第21

12、頁第21頁四、金黃色葡萄球菌檢查檢 樣7.5%NaCl肉湯血平板，Baird-Parker氏平板，卻甫曼氏平板血平板（分離培養(yǎng)）涂片鏡檢腸毒素試驗溶血性檢查血漿凝固酶致病性試驗檢 驗 報 告圖7-4 金黃色葡萄球菌檢查程序第22頁第22頁3. 血漿凝固酶試驗（1）玻片法 取一塊潔凈載玻片，一端滴加1:4新鮮兔（人）血漿，另一端滴加生理鹽水，然后以接種環(huán)挑取可疑菌落細(xì)菌少許，分別與血漿和生理鹽水相混合，若血漿混菌一端出現(xiàn)凝塊或顆粒狀，而生理鹽水混菌端仍均勻渾濁，則凝固酶為陽性，不然為陰性。（2）試管法 取1:4新鮮兔（人）血漿0.5ml，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml

13、，振搖均勻，放入（361）水浴鍋內(nèi)每0.5h觀測一次，觀測6h，如展現(xiàn)凝塊（半固體狀）為陽性，同時應(yīng)用已知凝固酶陽性或陰性菌株肉湯培養(yǎng)液作對照試驗。(注：假如玻片法和試管法結(jié)果不同，則以試管法作最終決定)4腸毒素試驗 將分離到可疑菌株，經(jīng)培養(yǎng)制備成腸毒素進(jìn)行檢驗；亦可使用待測樣品做成1:10、1:100稀釋液后，直接進(jìn)行動物試驗。本試驗最適動物是68周齡幼貓，也可用成年貓。按幼貓體重1ml/100g之量腹腔注射或喂飼處理過上清液或濾液，然后仔細(xì)觀測結(jié)果，如有葡萄球菌腸毒素存在，幼貓于15min4h內(nèi)發(fā)生嘔吐、寒顫、輕度腹瀉，經(jīng)45h后，逐步恢復(fù)正常。5致病性試驗 將分離到葡萄球菌接種于肉湯中，

14、37培養(yǎng)24h，取1.0ml培養(yǎng)液注射于家兔皮下，如有致病性葡萄球菌存在，則可引發(fā)局部皮膚潰瘍壞死。靜脈接種肉湯培養(yǎng)液0.10.5ml，2448h后，如有致病性葡萄球菌存在，解剖后可見漿膜出血，腎臟、心臟及其它臟器出現(xiàn)大小不等膿腫，切取組織塊觸片鏡檢。第23頁第23頁六、 金黃色葡萄球菌腸毒素快速檢查 PCR法 多重PCR是指在同一反應(yīng)體系中用多組引物同時擴(kuò)增幾種基因片段辦法。 第24頁第24頁第三節(jié) 沙門氏菌及沙門氏菌病 沙門氏菌（Salmonella）屬是腸桿菌科中一個屬，革蘭氏陰性細(xì)菌，包括2324個血清型。各種在形態(tài)結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)性狀，生化特性，抗原結(jié)構(gòu)等方面極為相同，它們能引起人類食物中

15、毒和動物沙門氏菌病。在各類細(xì)菌性食物中毒中，英國、中國沙門氏菌食物中毒占首位，美國沙門氏菌食物中毒占第二位，僅次于葡萄球菌食物中毒，日本沙門氏菌食物中毒占第三位，僅次于副溶血性弧菌和葡萄球菌食物中毒。第25頁第25頁沙門氏菌分成3大類（屬？）只感染人類菌 包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)、副傷寒A沙門氏菌(S.paratyphiA)、副傷寒C沙門氏菌(S.paratyphi C)。它們是造成傷寒熱和副傷寒熱病原菌，傷寒熱潛伏時間最長、造成發(fā)熱體溫最高，致死率也最高。傷寒沙門氏菌能夠在腸道發(fā)熱之前從患者血液或糞便、尿中分離出來。副傷寒熱癥狀比傷寒熱要溫和一些。 寄主適應(yīng)血清型(其中有些是人類病

16、原菌，能夠由食物中毒引起) 包括雞沙門氏菌(S.gallinarum)(感染家禽)、都柏林沙門氏菌(S.dublin)(感染牛)、馬流產(chǎn)沙門氏菌(S.abortysepui)(感染馬)、羊流產(chǎn)沙門氏菌(S.abortusovis)(感染羊)和豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)(感染豬)。非適應(yīng)血清型(非寄主型) 這些是人類和其它動物病原菌，它們包括多數(shù)食物起源血清型。第26頁第26頁一、生物學(xué)特性 (一) 形態(tài)特性及培養(yǎng)特性沙門氏菌菌體呈直桿狀，兩端鈍圓，130.40.9m，革蘭氏染色陰性，無莢膜，無芽孢，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外大多數(shù)有周生鞭毛，能運(yùn)動（圖7-5）。多數(shù)

17、細(xì)菌含有菌毛，能吸附于細(xì)胞表面或凝聚豚鼠紅細(xì)胞。形態(tài)上與大腸桿菌相同。普通營養(yǎng)瓊脂上經(jīng)37 1824h培養(yǎng)，形成直徑23mm正圓形菌落，菌落表面濕潤光滑，邊沿整潔或不整潔，無色半透明。從污水或食品中分離出一些沙門氏菌菌落表面干燥，無光澤，邊沿不整潔，屬粗糙型。雞傷寒、雞白痢、豬傷寒、甲型副傷寒等菌生長貧瘠形成較小菌落，在S.S瓊脂上，本菌形成淡桔紅色或粉紅色菌落；在遠(yuǎn)藤氏瓊脂上，菌落呈淡藍(lán)色或深藍(lán)色；在（B.T.B）乳糖瓊脂上菌落呈淡藍(lán)色或深藍(lán)色；在HE瓊脂上菌落呈黑心或黑色。圖7-5 沙門氏菌電鏡照片第27頁第27頁 (二) 生理生化特性生化反應(yīng)比較一致，但也有個別菌株個別特性有差別。本菌發(fā)

18、酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和梨醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖、蔗糖和水楊苷，不生成吲哚，V-P反應(yīng)陰性，不水解尿素和對苯丙氨酸不脫氨。除雞白痢、豬傷寒、甲型副傷寒、傷寒和蘚臺等沙門氏菌外，均能作用枸掾酸鹽。傷寒、雞傷寒及部分雞白痢沙門氏菌不發(fā)酵麥芽糖。培養(yǎng)時能夠利用氨基酸作為氮源，但鼠傷寒沙門氏菌也能夠利用硝酸鹽、亞硝酸鹽和NH3作為唯一氮源。普通不能利用乳糖發(fā)酵，但有些血清型能夠利用這種糖。除牛流產(chǎn)等少數(shù)沙門氏菌外，凡第一亞屬菌型都不能液化明膠。第28頁第28頁(三) 生長條件沙門氏菌最適培養(yǎng)溫度為37，最適pH為7.27.4，不耐熱，60 2030min即可殺死。 沙門氏菌最正確生長pH在中性附近，

19、在pH9.0以上和pH4.0以下會致死。 沙門氏菌生長上限溫度為45。 在中性pH環(huán)境下，當(dāng)aw值低于0.94時，沙門氏菌生長受到了克制，當(dāng)pH下降至生長極限值時，所需aw值較高。 與葡萄球菌不同是，沙門氏菌不能耐受較高鹽濃度。鹽濃度在9以上會致死沙門氏菌。 第29頁第29頁二、沙門氏菌起源和傳播路徑 沙門氏菌主要分布在動物腸道中，廣泛存在于豬、馬、牛、羊、家禽和鼠腸道、內(nèi)臟中，美國報道豬帶菌率為10.734.8，雞帶菌率為2.36.8，雞蛋帶菌率高達(dá)30，荷蘭報道豬帶菌率在30.1以上。其它動物通過昆蟲或其它路徑攝入時，這些微生物就再次通過腸道、糞便繼續(xù)循環(huán)。 沙門氏菌也能夠在污染水和食品中

20、廣泛存在。 第30頁第30頁三、沙門氏菌食物中毒癥狀及原因 由沙門氏菌引起食品中毒癥狀主要有惡心、嘔吐、腹痛、頭痛、畏寒和腹瀉等，還伴有乏力、肌肉酸痛、視覺模糊、中檔程度發(fā)熱、躁動不安和嗜睡，延續(xù)時間23d，平均致死率為4.1。其主要原因是由于攝入了含有大量沙門氏菌屬非寄主專一性菌種或血清型食品所引起。在攝入含毒食品之后，癥狀普通在1214h內(nèi)出現(xiàn)，有些潛伏期較長。 沙門氏菌病誘發(fā)涉及到兩種毒素腸毒素和細(xì)胞毒素。 第31頁第31頁四、沙門氏菌血清型（一）O抗原存在于菌體表面，其化學(xué)性質(zhì)為類脂多糖多肽復(fù)合物，由多糖決定其特異性，該抗原對熱穩(wěn)定。一個菌體有一個或各種不同O抗原。沙門氏菌O抗原共有6

21、5種，以阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3代表，有O抗原是幾個菌群共有，如1、5、6、12等，這些被稱為次要抗原，有些O抗原是某一菌群特有，如2、3、4、7、8、9、10、11等，其它菌群不含有，這些抗原被稱為主要抗原。依據(jù)主要抗原可將沙門氏菌屬分為50個O群。第32頁第32頁（二）H抗原 存在于鞭毛中，其化學(xué)性質(zhì)是蛋白質(zhì)，由肽鏈中氨基酸排列順序及空間構(gòu)型決定其特異性。該抗原不耐熱，酒精也可破壞其抗原性。H抗原經(jīng)常有兩相變異，第一相為特異相，用英文小寫字母表示；第二相為非特異相，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，但也有少數(shù)菌含有第一相中抗原、等成份。凡有兩相抗原稱為雙相菌，大多數(shù)沙門氏菌屬這類。含有一相H抗原稱為單相菌，如

22、腸炎沙門氏菌。很少數(shù)無鞭毛細(xì)菌兩相抗原均沒有，稱為無相菌，如雞白痢沙門氏菌。第33頁第33頁（三）Vi抗原 少數(shù)沙門氏菌如丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、新分離出來菌株，常含有這種包膜（Vi）抗原，通過幾次傳代、60加熱處理或石炭酸處理易于消失，Vi 抗原可制止O抗原與體結(jié)合，因此要進(jìn)行O凝集反應(yīng)，必須先洗掉Vi抗原。第34頁第34頁五、沙門氏菌檢測(一) 血清學(xué)分型鑒定1抗原制備 普通采用1.52.0瓊脂斜面培養(yǎng)物制備平板凝集抗原，假如O血清不凝集，用2.53.0瓊脂斜面培養(yǎng)物再檢查，假如是由于Vi抗原制止凝集反應(yīng)時，可用生理鹽水洗后并煮沸，再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌種接種在0.70.

23、8半固體瓊脂平板中央，待菌落蔓延生長時，在其邊沿部分取菌檢查。第35頁第35頁2抗原式鑒定 將抗原與AF群多價抗O血清作平板凝集試驗，同時用生理鹽水做對照，在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株，不能分型。鑒定全過程需用一周以上時間。假如只作普通性鑒定，可在三糖鐵培養(yǎng)基上蘸取可疑菌落進(jìn)行AF多價抗血清平板凝集試驗，即可較快作出判斷和鑒定。 第36頁第36頁(二) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測沙門氏菌PCR檢測沙門氏菌特異性，取決于所選擇擴(kuò)增靶序列是否為沙門氏菌高度保守特異片段。能否忠實(shí)地擴(kuò)增靶序列，由人工合成一對寡核苷酸引物序列決定。反之，引物設(shè)計又取決于沙門氏菌是否有具明顯特性屬或種特異性靶序列。

24、Golan等克隆并描述了鼠傷寒沙門氏菌一組基因(invA、B、C、D)，這組基因決定了沙門氏菌進(jìn)入上皮細(xì)胞能力，與沙門氏菌致病性密切相關(guān)，并在沙門氏菌中廣泛分布，而在非沙門氏菌中尚未發(fā)覺。這是當(dāng)前報道最多一組靶基因。第37頁第37頁Random amplified polymorphic DNA （RAPD） RAPD技術(shù)誕生時間很短, 但因為其獨(dú)特檢測DNA多態(tài)性方式以及快速、簡便特點(diǎn),使這個技術(shù)已滲透于基因組研究各個方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個)不同隨機(jī)排列堿基次序寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.聚丙烯酰

25、胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段多態(tài)性反應(yīng)了基因組對應(yīng)區(qū)域DNA多態(tài)性。RAPD所用一系列引物DNA序列各不相同,但對于任一特異引物,它同基因組DNA序列有其特異結(jié)合位點(diǎn).這些特異結(jié)合位點(diǎn)在基因組一些區(qū)域內(nèi)分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件,即引物在模板兩條鏈上有互補(bǔ)位置,且引物3端相距在一定長度范圍之內(nèi),就可擴(kuò)增出DNA片段.因此假如基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能造成這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生對應(yīng)改變,而使PCR產(chǎn)物增加、缺乏或發(fā)生分子量改變。經(jīng)過對PCR產(chǎn)物檢測即可檢出基因組DNA多態(tài)性。分析時可用引物數(shù)很

26、大,即使對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性區(qū)域是有限,不過利用一系列引物則能夠使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD能夠?qū)φ麄€基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP分子標(biāo)識進(jìn)行作圖分析。 第38頁第38頁(三) 免疫熒光標(biāo)識法檢測用熒光素標(biāo)識已知抗原(或抗體)，與特異抗體(或抗原)結(jié)合后產(chǎn)生熒光。 孫洋等人利用吖啶橙標(biāo)識免疫血清，用吖啶橙免疫熒光菌團(tuán)培養(yǎng)法檢測沙門氏菌，證實(shí)該檢測辦法對于34cfu/mL沙門氏菌均可檢出，與枯草桿菌，大腸埃希氏桿菌等八種雜菌均不形成菌團(tuán)交叉，與雜菌濃度比在1:640之內(nèi)均不受干擾，在30h內(nèi)即可取得結(jié)果。 第39頁第39頁(

27、四) 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是指將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后，用肉眼或分光光度計鑒定結(jié)果。最近，陶軍等簡介了一個國外自動酶標(biāo)免疫檢測儀，其原理是用酶熒光分析技術(shù)(ELFA)通過固相吸附器，用已知抗體捕獲目的生物體，然后以帶熒光酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充足沖洗后，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光陽性標(biāo)本，其對沙門氏菌檢測鑒定結(jié)果比較成熟，并已先后被美國FDA采用。 第40頁第40頁(五) 核酸探針檢測沙門氏菌當(dāng)前，檢測沙門氏菌探針屬特異性沙門氏菌探針已從鼠傷寒沙門氏菌E23566菌株染色體DNA克隆成功，并用于檢測食品中沙門

28、氏菌存在。 第41頁第41頁六、沙門氏菌控制嚴(yán)格執(zhí)行食品生產(chǎn)操作程序，注意滅蠅，加強(qiáng)對飲水、食品等衛(wèi)生監(jiān)督管理，以切斷傳染路徑。對食品加工和飲食服務(wù)人員定期進(jìn)行健康檢查，及時發(fā)覺帶菌者并給以治療或調(diào)離工作崗位。加強(qiáng)屠宰業(yè)衛(wèi)生監(jiān)督及各種食品尤其是肉類運(yùn)送、加工、冷藏等方面衛(wèi)生辦法，預(yù)防沙門氏菌污染。在食品加工過程中，必須嚴(yán)格按衛(wèi)生規(guī)范預(yù)防二次污染，通過蒸煮、巴氏消毒、存儲適宜溫度等進(jìn)行控制，都能預(yù)防沙門氏菌病發(fā)生。第42頁第42頁第四節(jié) 志賀氏菌及志賀氏菌病志賀氏菌屬（Shigella） 細(xì)菌（通稱痢疾桿菌），是細(xì)菌性痢疾病原菌。志賀氏菌既可通過水，也可通過食品傳播痢疾、腹瀉等疾病 .食源性志賀

29、氏菌病流行一個主要原因是從事食品加工行業(yè)人員患菌痢或帶菌者污染食品，食品接觸人員個人衛(wèi)生差等。志賀氏菌在衛(wèi)生條件不良環(huán)境下能快速傳播。志賀氏菌屬包括四個亞群： A群 痢疾志賀氏菌，有10個抗原構(gòu)成各不相同血清型，其中包括最著名志賀氏桿菌（型痢疾志賀氏菌）和舒密次桿菌（型痢疾志賀氏菌）。 B群 福氏志賀氏菌，有6個血清型，其中15又可分為兩個亞型，尚有x、y兩個變種，這些型、亞型和變種之間通過大量共同抗原系在一起。 C群 鮑氏志賀氏菌，有15個血清型，其中有血聯(lián)清型有甘露醇陰性變種。 D群 宋內(nèi)氏志賀氏菌，只有一個血清型，它含有光滑型和粗糙型變異。圖7-6 志賀氏菌電鏡照片第43頁第43頁一、志

30、賀氏菌形態(tài)結(jié)構(gòu)志賀氏菌屬細(xì)菌形態(tài)與普通腸道桿菌無明顯區(qū)別，為革蘭氏陰性桿菌，大小23 0.50.7m 。不形成芽孢、無莢膜、無鞭毛、有菌毛 .第44頁第44頁二、 培養(yǎng)與生理生化特性需氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，最適溫度為37，但在1040范圍內(nèi)亦能夠生長，在pH 6.47.8時生長良好，最適pH約為7.2。37培養(yǎng)1824h 后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色、半透明、邊沿整潔，直徑約2mm，在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，無菌膜形成。本菌屬都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。大多不發(fā)酵乳糖，靛基質(zhì)產(chǎn)生不定，甲基紅陽性，VP試驗陰性，不分解尿素，不產(chǎn)生H2S。依據(jù)生化反應(yīng)可進(jìn)行初

31、步分類。志賀氏菌基本生化特性見表7-4。第45頁第45頁項 目生化特性項 目生化特性項 目生化特性葡萄糖產(chǎn)氣-*靛基質(zhì)D在KCN中生長-乳糖-*甲基紅+苯丙氨酸脫氨酶-蔗糖-/+V-P-丙二酸鈉-甘露醇d枸櫞酸銨-賴氨酸脫羧酶-衛(wèi)矛醇d葡萄糖胺-精氨酸脫羧酶-水楊苷-H2S-鳥氨酸脫羧酶d側(cè)金盞花醇-尿素酶-動力-肌醇-明膠液化-第46頁第46頁三、 抗原結(jié)構(gòu) 第47頁第47頁四、志賀氏菌引起疾病及其預(yù)防志賀氏菌引起細(xì)菌性痢疾，主要通過消化道路徑傳播。依據(jù)宿主健康情況和年齡，只需少許病菌（至少為10個細(xì)胞）進(jìn)入，就有也許致病。 但是該菌在人體外生活力弱，在10-37度水中可生存20天，于牛奶、

32、水果、蔬菜中生存1-2周，糞便中（15-25度）可生存10天。光照30分鐘能夠殺死，加熱58-60度經(jīng)10-30分鐘即死亡。在志賀氏菌中，宋氏志賀氏菌和福氏志賀氏菌在體外生存力相對較強(qiáng)，志賀氏菌中毒也主要是這兩種菌引起。第48頁第48頁該菌中毒潛伏期普通為10-20天，短者6h，病人會出現(xiàn)猛烈腹痛、嘔吐及頻繁腹瀉，并伴有水樣便，便中混有血液和黏液，惡寒、發(fā)熱，體溫高者可達(dá)40度以上，有病人能夠出現(xiàn)痙攣。第49頁第49頁（一） 志賀氏菌致病作用主要是侵襲力、菌體內(nèi)毒素個別菌株能產(chǎn)生外毒素。1. 侵襲力 志賀氏菌進(jìn)入大腸后，由于菌毛作用粘附于大腸粘膜上皮細(xì)胞上，繼而進(jìn)入上皮細(xì)胞并在內(nèi)繁殖，擴(kuò)散至鄰

33、近細(xì)胞及上皮下層。由于毒素作用，上皮細(xì)胞死亡，粘膜下發(fā)炎，并有毛細(xì)吸管血栓形成以至壞死、脫落，形成潰瘍。志賀氏菌普通不侵犯其它組織，偶然可引起敗血癥。當(dāng)前認(rèn)為無論是產(chǎn)生外毒素還是只有內(nèi)毒素志賀氏菌，必須侵入腸壁才干致病。因此，對粘膜組織侵襲力是決定致病力主要原因。2. 內(nèi)毒素 志賀氏菌屬中各菌株都有強(qiáng)烈內(nèi)毒素，作用于腸壁，使通透性增高，從而增進(jìn)毒素吸取。繼而作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)，引起臨床上一系列毒血癥癥狀，如發(fā)熱、神志障礙，甚至中毒性休克。毒素破壞粘膜，形成炎癥、潰瘍，呈現(xiàn)典型痢疾膿血便。毒素作用于腸壁植物神經(jīng)，使腸道功效紊亂，腸蠕動共濟(jì)失調(diào)和痙攣，尤其直腸括約肌最明顯，因而發(fā)生腹痛

34、、里急后重等癥狀。 3. 外毒素 志賀氏菌型及部分型（斯密茲痢疾桿菌）菌株能產(chǎn)生強(qiáng)烈外毒素，為蛋白質(zhì)，不耐熱，7580 1h即可破壞。其作用是使腸粘膜通透性增長，并造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損害。外毒素經(jīng)甲醛或紫外線處理可脫毒成類毒素，能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗毒素。普通認(rèn)為含有外毒素志賀氏菌引起痢疾比較嚴(yán)重。第50頁第50頁內(nèi)毒素：內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中一個成份，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是有毒性。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來，因此叫做內(nèi)毒素。內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì)，因此非常耐熱。在100高溫下加熱1小時也不會被破壞，只有在160溫度下加熱2到4個小時，或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑

35、加溫煮沸30分鐘才干破壞它生物活性。與外毒素不同之處于于：內(nèi)毒素不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類毒素；把內(nèi)毒素注射到機(jī)體內(nèi)雖可產(chǎn)生一定量特異免疫產(chǎn)物（稱為抗體），但這種抗體抵消內(nèi)毒素毒性作用微弱。內(nèi)毒素脂多糖分子由菌體特異性多糖、非特異性關(guān)鍵多糖和脂質(zhì)A三部分組成。脂質(zhì)A是內(nèi)毒素主要毒性組分。不同革蘭氏陰性細(xì)菌脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)基本相同。因此，凡是由革蘭氏陰性菌引發(fā)感染，雖菌種不一，其內(nèi)毒素造成毒性效應(yīng)大致類同。這些毒性反應(yīng)主要有：發(fā)熱反應(yīng) 白細(xì)胞反應(yīng) 內(nèi)毒素休克 第51頁第51頁（二）防治辦法志賀氏菌隨糞便排出體外，通過食物、水和手經(jīng)口傳染給健康人。志賀氏菌痢疾預(yù)防關(guān)鍵是切實(shí)地把好“病從口入”這一關(guān)，

36、可從下列三個方面加以注意：1加強(qiáng)飲水衛(wèi)生 要保護(hù)水源，便桶不下河洗滌，新糞不下田，菌痢病人衣褲、病兒尿布不下河洗滌。要大力興辦自來水，搞好飲水消毒，嚴(yán)格做到不喝生水。2注意飲食和個人衛(wèi)生 嚴(yán)格執(zhí)行食品衛(wèi)生法各項要求。生熟分開，嚴(yán)格消毒食具。要自覺做到四不吃，即不吃生冷蔬菜、不吃不潔瓜果、不吃腐敗變質(zhì)食物、不吃未經(jīng)回鍋煮透剩菜剩飯。菌痢流行期間，不在病家或疫點(diǎn)內(nèi)辦酒席。在農(nóng)村要切實(shí)做到直接入口食品不下河洗滌，還要防蠅、滅蠅。工作后、學(xué)習(xí)后、外出回家后要洗手，尤其是食前、便后要洗手，勤剪指甲。3使用痢疾口服菌苗 當(dāng)前正在試用痢疾口服菌苗，主要有Sd（依鏈菌株）口服活疫苗。菌苗只對同型菌再感染有保護(hù)

37、力，故使用時應(yīng)考慮到當(dāng)?shù)爻Ｒ娏餍芯?。?2頁第52頁五、志賀氏菌檢查細(xì)菌學(xué)檢查 GB4789.5-1944第53頁第53頁六、志賀氏菌快速檢查 依據(jù)侵襲性大質(zhì)粒 Hind 片段2.5kb區(qū)域（侵襲性相關(guān)位點(diǎn)ial基因）設(shè)計引物，建立PCR檢測辦法存在較高基因缺失率，而侵襲性大質(zhì)粒也可因培養(yǎng)、貯存、傳代而丟失，常出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 PCR辦法檢測福氏、鮑氏、痢疾、宋內(nèi)氏志賀氏菌原則菌株和保留菌株所有擴(kuò)增出與預(yù)期相符512bpDNA片段，而其它腸道菌均未出現(xiàn)擴(kuò)增帶，所有試驗過程僅需 810h。 第54頁第54頁第五節(jié) 空腸彎曲桿菌及食物中毒彎曲菌屬（Campylobacter）包括14個菌種，其中

38、與食物中毒最密切相關(guān)是空腸彎曲菌空腸亞種（C.jejuni subsp.jejuni）。普通將空腸彎曲桿菌亞種稱為空腸彎曲桿菌，它與大腸彎曲(Campylobacter coli)菌區(qū)別是，它能夠水解馬尿酸。按血清分類，空腸彎曲菌有48種以上血清型 ?？漳c彎曲桿菌不是一個環(huán)境微生物，而是一個與溫血動物相關(guān)微生物，它在肉用動物糞便中出現(xiàn)百分比很高，尤其是以家禽糞便中含量最高。 第55頁第55頁彎曲桿菌在家禽家畜中污染比較普遍，據(jù)美國有線廣播公司報道，在美國飼養(yǎng)食用雞中，70%-90%都帶有彎曲桿菌。前幾年，我國調(diào)查發(fā)覺，上海禽蛋加工廠雞帶菌率為58%，杭州養(yǎng)雞場雞帶菌率高達(dá)93.7%。人若食用了

39、沒有煮熟雞肉就可受染。另外，牛、豬等家畜也能傳播此菌。帶菌奶牛糞便或分泌物?？晌廴九Ｄ?，而致人發(fā)病。80年代英國先后發(fā)生13起未經(jīng)巴氏消毒牛奶(生牛奶)而引起4500人發(fā)病嚴(yán)重情況。據(jù)紐約時報預(yù)計，美國每年至少有200-800萬人因吃了沒有煮熟雞肉而感染彎曲桿菌，并造成200-800人死亡。令醫(yī)生們頭痛是，近年由于讓雞服用一個專門對付彎曲桿菌抗菌素后，越來越多雞體、甚至人體，產(chǎn)生了一個抗藥性很強(qiáng)彎曲桿菌，給治療帶來一定難度。第56頁第56頁一、生物學(xué)特性空腸彎曲桿菌屬革蘭氏染色陰性菌，不產(chǎn)生芽孢，呈弧形，螺旋形或S形，菌大小為1.550.20.5m。在細(xì)胞一端或兩端著生有單極鞭毛，長度為菌體2

40、3倍，能運(yùn)動（圖7-8）。新鮮培養(yǎng)物在相差或暗視野顯微鏡下觀測，呈跳躍或射標(biāo)樣運(yùn)動。陳舊培養(yǎng)基或培養(yǎng)環(huán)境改變時其形態(tài)易變?yōu)榍蛐尾适恿ΑＴ摼谄胀ㄅ囵B(yǎng)基上難以生長，在凝固血清和血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)36h，可見無色半透明毛玻璃樣小菌落，單個菌落呈中心凸起，周圍不規(guī)則，無溶血現(xiàn)象。圖7-8 空腸彎曲桿菌電鏡照片第57頁第57頁(二) 生化特性不液化明膠，甲基紅和V-P試驗均為陰性氧化酶試驗為陽性不發(fā)酵葡萄糖及其它糖醇苷類還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，產(chǎn)生靛青質(zhì)。除個別菌株外，均無色素產(chǎn)生。不產(chǎn)生H2S，尿素酶陰性，觸媒陽性在3.5NaCl環(huán)境中不生長1甘氨酸中生長在馬尿酸鈉培養(yǎng)基中生長，在TTC培養(yǎng)基上菌

41、苔呈紫色光澤。第58頁第58頁(三) 生長條件空腸彎曲桿菌對環(huán)境非常敏感，不也許在宿主外存活時間太長，屬于寄生菌。在多氧或絕對無氧條件下不能生長，生長需要微氧環(huán)境，在含氧2.5%5%和10% CO2環(huán)境中生長最好，在含氧310時也能生長，生長溫度為3643，最適溫度為42。低于25不能生長。生長pH范圍為7.09.0，最適pH為7.2。 第59頁第59頁 (四) 抵抗力本菌抵抗力不強(qiáng)，易為干燥、直射陽光及弱消毒劑等殺滅，58 5min可殺死。對青霉素、頭孢霉素耐受，對紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素敏感。該菌不耐熱，巴氏滅菌條件下就能夠致死。 第60頁第60頁二、起源及分布空腸彎曲桿菌是一個常見人畜共

42、患病原菌，糞是主要傳播路徑。該菌能夠通過動物、鳥和患者糞便進(jìn)入環(huán)境中，包括飲用水、污染水、生牛奶和禽肉是人類感染空腸彎曲桿菌最主要傳染源。彎曲菌屬廣泛散布在各種動物體內(nèi)，其中以家禽、野禽和家畜帶菌最多。另外在嚙齒類動物體內(nèi)也分離出彎曲菌，病菌通過其糞便排出體外，污染環(huán)境。 第61頁第61頁三、中毒癥狀及致病機(jī)理（一）中毒癥狀當(dāng)前，空腸彎曲桿菌是世界上大多數(shù)地域常見引起腹瀉最主要病原菌，也是人畜共患病原菌。潛伏期110d，平均5d，食物中毒型潛伏期僅20h。早期有頭痛、發(fā)熱、肌肉酸痛等前驅(qū)癥狀，隨后出現(xiàn)腹瀉、惡心嘔吐。驟起者開始發(fā)熱、腹痛腹瀉。發(fā)熱約占56.3%60%，普通為低到中度發(fā)熱，體溫3

43、8左右，個別可高熱達(dá)40，伴有全身不適，兒童可伴有高熱。腹痛腹瀉為最常見癥狀。 第62頁第62頁(二) 致病機(jī)理空腸彎曲菌中至少有一些菌株能夠產(chǎn)生熱敏型腸毒素（CJT），它與大腸桿菌毒素(LT)有一些相同性質(zhì)，彎曲菌毒素能升高cAMP水平，誘導(dǎo)在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中變換，并能造成回腸彎曲部位液體積累。 它還也許產(chǎn)生一個細(xì)胞毒素，能夠作用于維洛細(xì)胞和海拉細(xì)胞。 尚有一部分食物中毒是由大量活菌侵入腸道引起感染型食物中毒。第63頁第63頁第七節(jié) 單核增生李斯特氏菌及其食物中毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，是一個能在冷藏溫度下存活致病菌。由于其細(xì)胞 苯酚-水浸出物能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞生成，而取得了“單核增生細(xì)菌”

44、這個種名。 當(dāng)前已知李斯特菌屬有七個菌種，即單核增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）、綿羊李斯特氏菌（L.ivanovii）、英諾克李斯特氏菌（L.innocua）、威爾李斯特氏菌（L.welshimeri）、西爾李斯特氏菌（L.seeliger）、格氏李斯特氏菌（L.grayi）和莫氏李斯特氏菌（L.murrayi）。 第64頁第64頁約瑟夫李斯特 公元1827公元1912，倫敦大學(xué)學(xué)院優(yōu)等生，于1852年在該院取得醫(yī)學(xué)學(xué)士。1861年他成為格拉斯哥皇家醫(yī)院外科醫(yī)生，一直干了八年。也就是在這個時期他創(chuàng)造了外科防腐技術(shù)。隨即在1865年，李斯特讀到了路易巴斯德一篇論文，豁然開朗，認(rèn)

45、識了疾病細(xì)菌學(xué)說。李斯特用石炭酸做滅菌劑，建立了一套新滅菌法。 李斯特發(fā)覺使外科學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了徹底革命，拯救了千百萬人生命。今天不但死于術(shù)后感染患者極為少見，而且也救活了許多這么人：假如感染危險還象前一個世紀(jì)一樣大話，他們是不會愿意接受手術(shù)治療。而且現(xiàn)在外科能夠做那些早先認(rèn)為感染危險如此之大以致被列入禁區(qū)復(fù)雜手術(shù)。比如，一個世紀(jì)前，開胸手術(shù)普通不給予考慮。即使現(xiàn)今無菌外科技術(shù)和李斯特滅菌方法有所不同，不過前者與后者所包括思想基本相同，是李斯特原理擴(kuò)展。 1877年李斯特被任命為倫敦皇家學(xué)院臨床外科教授，一任就是十五年之久。他在倫敦做滅菌外科演示試驗，引發(fā)了醫(yī)學(xué)界濃厚興趣，接受他思想人在不停增多。

46、到李斯特享盡天年之時，他滅菌原理在醫(yī)學(xué)界被普遍接受。第65頁第65頁1999年終，美國發(fā)生了歷史上因食用帶有李斯特菌食品而引起最嚴(yán)重食物中毒事件，據(jù)美國疾病控制和防治中心資料顯示，在美國密歇根州有14人因食用被該菌污染 “熱狗”和熟肉而死亡，在另外22個州97人患此病，6名婦女流產(chǎn)。1992-1995年法國出產(chǎn)奶酪及豬肉中發(fā)覺李斯特菌，11月以來，我國質(zhì)檢部門多次從美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時、丹麥等二十多家肉類加工廠進(jìn)口豬腰、豬肚、豬耳、小排等三十多批近千噸豬副產(chǎn)品中檢出單增李斯特菌、沙門氏菌等致病菌。第66頁第66頁一、生物學(xué)特性 （一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)該菌為小革蘭氏陽性類球形桿菌，大小約

47、為 0.40.50.52.0m，圓端，直或稍彎，單個、呈V字型排列或成對排列，兼性厭氧、無芽孢，普通不形成莢膜，但在營養(yǎng)豐富環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)物中菌體可呈絲狀、革蘭氏染色陰性，2025以4根周毛運(yùn)動，37時只有較少鞭毛或1根鞭毛（圖7-11）。細(xì)胞壁含20%己糖（葡萄糖和半乳糖）、5%己糖胺和5%含有丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、天門冬氨酸和亮氨酸蛋白質(zhì)。它們不含有甘氨酸和絲氨酸，可與豬丹毒絲菌區(qū)別開。圖7-11 單核增生李斯特氏菌電鏡照片第67頁第67頁（二）培養(yǎng)特性在一個含0.25%瓊脂、8.0%明膠和1.0%葡萄糖半固體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)24h，生長物沿穿刺線以不規(guī)則云霧狀延伸

48、到培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)而擴(kuò)散到整個培養(yǎng)基。生長達(dá)最高量時在培養(yǎng)基表面下35mm處形成一似傘狀界面。羊肝浸出液瓊脂上菌落：圓形、光滑、奶油狀、稍扁平，用透過光觀測是透明，而用反射光觀測為乳白色?？蓞^(qū)分為光滑型、中間型和粗糙型菌落。在蛋白胨瓊脂上生長物比羊肝浸出液瓊脂上稀薄。在血瓊脂上生長良好，菌落四周有狹窄溶血帶，因血種類而有改變。有少數(shù)菌株強(qiáng)烈溶血，其它菌株則溶血性弱。水解吐溫-80和吐溫-20。產(chǎn)生磷脂酶在卵黃培養(yǎng)基上能生成不同程度不透明物，含有顯著解脂作用菌株通常也有強(qiáng)烈溶血作用。 第68頁第68頁該菌生長需要B族維生素（生長素、核黃素、硫胺素和硫辛酸）和氨基酸（半胱氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨

49、酸和纈氨酸）。 該菌生長范圍為242（也有報道在0能緩慢生長），最適生長溫度為37；pH中性至弱堿性（pH9.6），有些菌種可在pH4.19.6范圍內(nèi)生長；氧分壓略低、二氧化碳壓力略高條件下該菌生長良好。第69頁第69頁（三）生化反應(yīng)該菌觸酶陽性氧化酶陰性能發(fā)酵各種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖不利用枸櫞酸鹽40%膽汁不溶解吲哚、硫化氫、尿素陰性明膠不液化硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸陰性VP陽性甲基紅試驗陽性精氨酸水解陽性第70頁第70頁（四）血清

50、型依據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李斯特氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 個血清型。 致病菌株血清型普通為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b，尤其是后兩種。 第71頁第71頁（五）抵抗力該菌對理化原因抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青儲飼料和干草內(nèi)能長期存活，對堿和鹽抵抗力強(qiáng)，25g/L氫氧化鈉經(jīng)20min才被殺死，在20%氯化鈉中4可存活8周6070 520min可殺死70%酒精、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌。該菌對青霉素、氨芐青

51、霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、新霉素、磺胺均敏感，抗多黏菌素。第72頁第72頁二、致病臨床表現(xiàn)主要有兩種類型： 侵襲型和腹瀉型 侵襲型潛伏期為2-6周，病人開始常有胃腸炎癥狀，最明顯表現(xiàn)是敗血癥、腦膜炎、發(fā)熱，有時可引起心內(nèi)膜炎。孕婦、新生兒、免疫缺點(diǎn)人為易感人群。 對于孕婦可造成流產(chǎn)、死胎等結(jié)果，對于幸存嬰兒則易患腦膜炎，造成智力缺點(diǎn)或死亡；對于免疫系統(tǒng)有缺點(diǎn)人易出現(xiàn)敗血癥、腦膜炎。少數(shù)輕癥病人僅有流感樣表現(xiàn)。病死率高達(dá)20%-50%。腹瀉病人潛伏期一般為8-二十四小時，主要癥狀為腹瀉、腹痛、發(fā)熱。第73頁第73頁三、致病機(jī)理 （一）李斯特菌綜合癥 單增李氏菌抗原結(jié)構(gòu)與毒力無關(guān)，它致病性與毒

52、力機(jī)理下列：1、寄生物介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞；2、抗活化巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)過氧物（為殺菌毒性游離基團(tuán)）分解；3、溶血素，即李斯特桿菌溶血素O，能夠從培養(yǎng)物上清液中取得，為SH活化細(xì)胞溶素，有和兩種，為毒力因子。第74頁第74頁（二）單核增生李斯特氏菌致病基因prfA基因簇 prfAplcAhlymplactAplcBhly單順反子編碼一個帶有膽固醇成孔毒素“李斯特菌溶血素O” (LLO)5.7kb操縱子 actA編碼表面蛋白ActA,對于李斯特氏菌致病性也是必不可少 Mpl同PlcB同樣也是一個Zn-金屬酶。PlcB和Hl

53、y一起破壞李斯特氏菌被吞噬后形成吞噬泡，但是PlcB主要作用是介導(dǎo)溶解李斯特菌胞間擴(kuò)張后形成吞噬體雙分子膜。 plcA、prfA操縱子: plcA編碼一個對磷酸肌醇特異磷脂酶C，協(xié)同Hly和PlcB在最初干擾吞噬體； prfA編碼PrfA蛋白，是一個與腸桿菌Crp蛋白結(jié)構(gòu)功效相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。 操縱子 PrfA是當(dāng)前李斯特氏菌中唯一毒性調(diào)控因子，負(fù)責(zé)調(diào)控分布于染色體上與侵襲作用相關(guān)多基因家族所有組員。 第75頁第75頁內(nèi)化素 內(nèi)化素是侵入宿主細(xì)胞主要毒性原因，但當(dāng)前仍不清楚它在李斯特氏菌致病性確實(shí)切作用。經(jīng)過一些體內(nèi)試驗發(fā)覺，與細(xì)胞壁相連內(nèi)化素inlA和inlB對于發(fā)動敏感、正常、非吞噬細(xì)胞侵襲是

54、必要和足夠。 大分子量內(nèi)化素和小分子量內(nèi)化素在表示上有很大不同。大分子量內(nèi)化素表示不受prfA控制，它們在細(xì)胞外營養(yǎng)豐富肉湯培養(yǎng)基上強(qiáng)烈表示，在細(xì)胞內(nèi)表示很弱，這跟inlA和inlB介導(dǎo)從胞外環(huán)境進(jìn)入胞內(nèi)內(nèi)化作用是一致。相反，小分子量內(nèi)化素基因表示都受prfA控制，在肉湯培養(yǎng)基以及胞外高鐵環(huán)境中表示受到克制，但在宿主細(xì)胞內(nèi)被優(yōu)先激活。 第76頁第76頁四、機(jī)體免疫 巨噬細(xì)胞對T-細(xì)胞作用是主要，它們對于摧毀單核增生李斯特氏菌和一些其它細(xì)胞內(nèi)病原菌是必需。首先，巨噬細(xì)胞與單增李斯特氏菌細(xì)胞結(jié)合，并將它“引渡”給T-細(xì)胞，以至于T-細(xì)胞將它當(dāng)作入侵者。當(dāng)T-細(xì)胞與細(xì)菌作用時，T-細(xì)胞體積增大，形成

55、專門對付這種微生物有機(jī)體或抗體。這些T-細(xì)胞激活以后，分泌白細(xì)胞介素-1（IL-1）。 -干擾素誘導(dǎo)作用于單核細(xì)胞IL-2受體產(chǎn)生。IL-2能夠增進(jìn)（被淋巴激活素激活）“殺菌子”細(xì)胞激活，這種殺菌子能夠溶解感染后巨噬細(xì)胞。當(dāng)巨噬細(xì)胞吞噬了單核增生李斯特氏菌時，會在感染位點(diǎn)分泌一個產(chǎn)單核細(xì)胞增進(jìn)因子（FIM）。這種增進(jìn)因子轉(zhuǎn)移到骨髓中后，會增進(jìn)更多巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。 第77頁第77頁五、單核增生李斯特氏菌檢測（一）老式分離鑒定辦法 選擇性增菌法 老式單核增生李斯特菌檢測辦法全過程需47d，并且沒有一個培養(yǎng)基能夠全面保持所有食品基質(zhì)或各種李斯特菌血清型，因此李斯特菌分離培養(yǎng)辦法仍在探討和改進(jìn)中。 第7

56、8頁第78頁（二）免疫學(xué)檢測辦法免疫學(xué)檢測辦法就是利用抗原-抗體反應(yīng)明顯特異性，而建立一個快速檢測食品中病原菌辦法。 ELISA法檢測極限在105106cfu/ml，因此鑒定前同樣需進(jìn)行選擇性增菌及后增菌，以增進(jìn)鞭毛發(fā)育。 第79頁第79頁（三）核酸檢測辦法核酸檢測辦法以李斯特菌屬或種特異核酸序列互補(bǔ)序列為探針，進(jìn)行李斯特菌屬或種水平鑒定。與ELISA法相同，探針雜交技術(shù)檢測極限為105106cfu/ml，因此對李斯特氏菌檢出仍需一系列培養(yǎng)、純化等附加試驗。 PCR法第80頁第80頁第八節(jié) 肉毒梭菌、肉毒梭菌毒素及其食物中毒 肉毒梭菌是革蘭氏陽性厭氧菌，可產(chǎn)生芽胞。在厭氧環(huán)境中能產(chǎn)生強(qiáng)烈外毒素

57、，即肉毒毒素。肉毒毒素是一個強(qiáng)烈神經(jīng)毒，攝入含有該毒素食品，即可引起肉毒中毒。 該菌在自然界分布十分廣泛，大量存在于土壤、水源和植物中，其中以土壤為多見。在報道案件中，我國引起中毒食品多是家庭自制發(fā)酵食品如：臭豆腐、豆瓣醬、玉米糊糊等。國外引起中毒食品則多是家庭自制各種罐頭和熏制、腌制食品。 第81頁第81頁一、肉毒梭菌及其生物學(xué)特性 形態(tài)特性: 肉毒梭菌為革蘭氏陽性桿菌，460.91.2m，多數(shù)情況下菌體單個存在，偶然成對或成短鏈，菌端鈍圓，不形成莢膜，有周身鞭毛，能運(yùn)動，能形成芽孢，芽孢呈卵圓形至圓筒形。肉毒梭菌為嚴(yán)格厭氧菌，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上都能生長。生長和產(chǎn)生毒素最適溫度為

58、：蛋白分解型菌株靠近35，低于12.5普通不能生長；非蛋白分解型菌株大約為26，其中B、E、F型菌株在冷藏溫度（34）下也能產(chǎn)生毒素；產(chǎn)生毒素最適pH為7.88.2。 圖7-12 肉毒梭菌電鏡照片第82頁第82頁（二）生理生化特性肉毒梭菌生化特性很不規(guī)律，普通能分解葡萄糖、麥芽糖和果糖，同時產(chǎn)酸產(chǎn)氣；對明膠、凝固血清、凝固蛋白有分解作用，并引起液化；不利用乳糖、甘露醇，不產(chǎn)生吲哚，不形成靛基質(zhì)能產(chǎn)生硫化氫。第83頁第83頁肉毒梭菌抵抗力不強(qiáng)，但其芽孢抵抗力很大，可耐煮沸16h之久，于180干熱515min，120高壓蒸氣下1020min才干殺死，10鹽酸需經(jīng)1h才干破壞；在酒精中能存活2個月。

59、其中A、B型菌芽孢抵抗力最強(qiáng)。 第84頁第84頁二、肉毒毒素及其性質(zhì) 肉毒梭菌本身是一個腐生菌，肉毒毒素是肉毒梭菌在生長繁殖過程中于胞漿中產(chǎn)生一個外毒素，由菌體釋放到培養(yǎng)基中，經(jīng)除菌膜過濾所得濾液即為毒素液。與經(jīng)典外毒素不同，它普通不是由活細(xì)菌所釋放，而是細(xì)菌死亡自溶時才游離出來。肉毒毒素屬于高分子蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素，能引發(fā)人和動物肉毒中毒。依據(jù)肉毒梭菌神經(jīng)毒素抗原特異性，可將肉毒梭菌產(chǎn)生毒素分別為A、B、C(C、C)、D、E、F和G等7種血清型。普通一菌株只產(chǎn)生一個神經(jīng)毒素，少數(shù)可產(chǎn)生各種神經(jīng)毒素，而有些菌株除產(chǎn)生神經(jīng)毒素外，還可產(chǎn)生其它毒素。如C、D型菌株除分別產(chǎn)生C、D神經(jīng)毒素外，還可產(chǎn)生兩

60、種ADP-核糖酰轉(zhuǎn)移酶C2和C3。肉毒毒素毒性極強(qiáng)，是當(dāng)前所知最強(qiáng)烈細(xì)菌外毒素。對人致死量為1 ng/kg體重，其毒力比KCN還大10000倍。 第85頁第85頁三、檢查 肉毒梭菌在自然界中廣泛存在，但本身并不致病，引起致病是肉毒毒素。依據(jù)國家原則食品衛(wèi)生檢查辦法微生物學(xué)部分肉毒梭菌及肉毒毒素檢查（GB4789.12-84）辦法進(jìn)行檢查。至少需4d 第86頁第86頁血清學(xué)試驗 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）可用于檢測A型和E型肉毒毒素 PCR法 由于肉毒中毒最后是由肉毒神經(jīng)毒素引起，而PCR只能檢測肉毒梭菌，因而PCR用于診斷肉毒中毒尚存兩個問題。其一，食品中也許存在毒素但不存在菌；其二，也