酶的生物合成法生產(chǎn)市公開課獲獎課件

1、第三章 酶生物合成與發(fā)酵生產(chǎn) 第1頁第1頁酶生產(chǎn)辦法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from AspergillusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew example第2頁第2頁 第一

2、節(jié) 酶生物合成及調整一、酶生物合成 遺傳信息傳遞中心法則轉錄傳遞給RNA，再由RNA 蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA 第3頁第3頁（一）RNA生物合成-轉錄(transcription) 定義 以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉錄酶）作用下，生成RNA分子過程。.第4頁第4頁轉錄模板 啟動子（promotor) 終止子(terminator)模板鏈（template strand）反意義鏈(antisense strand)編碼鏈 (coding strand)故意義鏈(sense strand)DNA5533反意義鏈:指導轉錄作用一條DNA鏈故意義鏈:無轉錄功效

3、一條DNA鏈.第5頁第5頁T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶故意義鏈反意義鏈RNAPPi553GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上生物合成335第6頁第6頁RNA轉錄過程(三步)1.起始2.延長3.終止 第7頁第7頁 原核生物RNA聚合酶(DDRP)E. coliRNA聚合酶是由四種亞基構成五聚體（ 2 ）起始因子第8頁第8頁RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達基因終點延長階段53RNA 啟動子（promotor) 終止子(terminator)5RNA聚合酶535355

4、3離開第9頁第9頁RNA鏈延伸圖解35RNA-DNA雜交螺旋聚合酶移動方向新生RNA復鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位第10頁第10頁 定義 以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子作用，合成多肽鏈過程。（二）蛋白質生物合成-翻譯(translation) 第11頁第11頁酪553AUGGUU UAC ACA酪氨酰- tRNA反密碼mRNA密碼與反密碼堿基配對第12頁第12頁AUG ACA5蛋蘇UGUGUU3受 位(A位)給 位(P位)大亞基小亞基第13頁第13頁 蛋白質合成過程 （大腸桿菌） 氨基酸活化 肽鏈合成起始 肽鏈延伸 肽鏈合成終止與釋放第14頁

5、第14頁氨基酸活化與轉運反應式：AA + tRNA + ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi 對于E.coli而言，肽鏈合成時第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。第15頁第15頁在核糖體上合成多肽（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段第16頁第16頁肽鏈合成起始階段1.mRNA與小亞基結合：形成30S-mRNA-IF3復合物2.AUG與蛋氨酰-tRNA結合： 30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正好位于mRNA起始密碼子上（AUG）。3.大小亞基結合IF130S起始復合物第17頁第17頁AUG ACA53AUG AC

6、A53UACUACAUG ACA53小亞基mRNA蛋氨酰tRNA GTP大亞基GDP+Pi受位給位蛋蛋肽鏈合成起始階段第18頁第18頁肽鏈合成延伸階段1.進位:氨基酰-tRNA進入受位;2.轉肽:形成肽鍵,在轉肽酶作用下,給位與 受位結合;3.移位:核蛋白體向3端移動一個密碼子 位置,空出受位,不斷地進位、轉肽、 移位,使肽鏈延長。第19頁第19頁AUG ACA53UAC蛋蘇UGUAUG ACA5UAC蛋蘇UGUGUUAUG ACA5UAC蛋蘇UGUGUUAUG ACA5蛋蘇UGUGUU333GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始復合體進位轉肽移位Mg+K+第20頁第20頁肽鏈合成終止階段

7、1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結合;2.肽鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離. 第21頁第21頁AUG UAA5UACAUG UAA5UAC33終終AUG UAA5UAC3終53UAC終肽鏈第22頁第22頁第23頁第23頁二、酶生物合成調整定義：通過調整酶合成量來控制微生物代謝速度調整機制，是在基因轉錄水平上進行。意義：通過制止酶過量合成，節(jié)約生物合成原料和能量。第24頁第24頁 操縱子基因表示協(xié)同單位操縱子結構基因（編碼蛋白質, structural gene, S）控制部位操縱基因（operator gene, O）啟動子（promotor gene, P）（一）基因調控

8、理論 Jacob and Monod操縱子學說（operon theory） 第25頁第25頁結構基因（Structural gene）: 決定某一多肽DNA模板，與酶有各自相應關系，其中遺傳信息可轉錄為mRNA，再翻譯為蛋白質。第26頁第26頁 cAMP-CRP復合物作用示意圖 啟動基因（promotor gene）（啟動子）： 有兩個位點： （1）RNA聚合酶結合位點（2）cAMP-CAP結合位點。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP

9、-CRP復合物結合到啟動子位點上，RNA聚合酶才干結合到其在啟動子位點上，酶合成才干開始。 第27頁第27頁操縱基因（Operater gene）: 位于啟動基因和結構基因之間一段堿基順序，能特異性地與調整基因產(chǎn)生變構蛋白結合，操縱酶合成時機與速度。第28頁第28頁 調整基因(regulator gene)： 可產(chǎn)生一個構成型調整蛋白(regulatory protein) （一個變構蛋白），通過與效應物(effector) （包括誘導物和輔阻遏物）特異結合而發(fā)生變構作用，從而改變它與操縱基因結合力。 調整基因常位于調控區(qū)上游。第29頁第29頁基因操縱子調整系統(tǒng)示意圖 調整基因 啟動基因 操縱

10、基因 結構基因 DNA 轉錄 （-） RNA聚合酶 （+） 轉錄 翻譯 mRNA 翻譯 調整蛋白 蛋白質 效應物控制區(qū) 信息區(qū)操縱子第30頁第30頁(二) 酶合成調整類型 1.誘導 (induction) 構成酶：細胞固有酶類。 誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似 物而暫時合成一類酶。 2.阻遏 (repression) 分解代謝物阻遏(catabolite repression) 反饋阻遏(feedback repression)第31頁第31頁（三）酶合成調整機制 1. 酶合成誘導加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。 酶合成誘導現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖酶有： -半乳糖苷酶； -

11、半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。試驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成經(jīng)濟原則：需要時才合成。第32頁第32頁調整基因操縱基因乳糖酶結構基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏物(調整蛋白)（有活性）基 因 關 閉啟動子ORPLacZLacYLaca調整基因操縱基因乳糖酶結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏物 （無活性） 基 因 表示mRNAA、乳糖操縱子結構B、乳糖酶誘導 乳糖(效應物)阻遏物 （有活性）誘導第33頁第33頁 2.反饋（末端產(chǎn)物）阻遏

12、由某代謝路徑末端產(chǎn)物過量累積引起阻遏。 酶合成阻遏現(xiàn)象： 試驗： （1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖培養(yǎng)基上時， 檢測到細胞內(nèi)有色氨酸合成酶存在； （2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)覺細胞內(nèi)色氨酸合成酶活性減少，直至消失。 （3）表明色氨酸存在制止了色氨酸合成酶合成，表達了菌體生長經(jīng)濟原則:不需要就不合成。第34頁第34頁 色氨酸操縱子酶阻遏調整基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表示調整基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結合，使之構象發(fā)生改變與操縱基因結合，結構基因不能表示調整蛋白第35頁第35頁酶誘導和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏物加誘導劑

13、A.有活性阻遏物C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調整基因結構基因 阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表示誘導物誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因作用,結構基因能夠表示酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合, 結構基因能夠表示阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表示代謝產(chǎn)物第36頁第36頁調控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結合阻遏效應舉例酶誘導有活性不轉錄，繼而不翻譯誘導物轉錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶阻遏無活性阻遏物不轉錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成誘導與阻遏操縱子模型調控

14、作用對比第37頁第37頁3.分解代謝物阻遏指細胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快那種分解底物會阻遏利用慢底物相關酶合成現(xiàn)象。分解代謝物阻遏作用，并非由于快速利用甲碳源本身直接作用結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生中間代謝物所引起阻遏作用。第38頁第38頁分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 試驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期“二次生長現(xiàn)象”(diauxie或biphasic growth）。 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應，產(chǎn)生原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系合成。此調整基因產(chǎn)物是

15、環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。第39頁第39頁分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基 因 表示CRP基因結構基因TCRPOCAP結合部位 RNA聚合酶TcAMP -CRPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5-AMP克制激活葡萄糖降解物與cAMP關系cAMPCRP：環(huán)腺苷酸受體蛋白或降解物(分解代謝產(chǎn)物)基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）減少cAMP濃度使CRP呈失活狀態(tài)第40頁第40頁三、提升酶產(chǎn)量策略（一）菌種選育（一勞永逸） 1.誘變育種 (1)

16、使誘導型變?yōu)闃嫵尚瓦x育構成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?選育營養(yǎng)缺點型突變株解除反饋阻遏 選育結構類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種 第41頁第41頁（二）條件控制1. 添加誘導物 酶底物類似物最有效。2. 減少阻遏物濃度 除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏 添加制止產(chǎn)物形成克制劑 避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏 避免培養(yǎng)基過于豐富 添加一定量cAMP第42頁第42頁3.添加表面活性劑 離子型 對細胞有毒害作用表面活性劑 Tween80 非離子型 增長細胞通透性 TritonX1004. 添加產(chǎn)酶增進劑第43頁第43頁 第二節(jié) 酶發(fā)酵動力學 一、細胞生長動力學

17、在分批培養(yǎng)(batch culture)過程中，細胞生長普通要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長期、減速期、靜止期和衰亡期5個階段。第44頁第44頁 細胞生長曲線 O-A 延遲期 A-B指數(shù)生長期 B-C減速期 C-D 靜止期 D-E 衰亡期 第45頁第45頁 營養(yǎng)物濃度（生長限制基質濃度）和生長速率之間動力學關系：Monod模型:比生長速率（1/h） （specific growth rate）max：最大比生長速率（1/h）S：營養(yǎng)物濃度（生長限制基質濃度） 克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營養(yǎng)物利用常數(shù) 克/L，或 mol/L第46頁第46頁 二、產(chǎn)酶動力學 （一） 酶生物合成模式 依據(jù)酶合成與細胞

18、生長之間關系，可將酶生物合成份為3種模式，即： 同時合成型 生長偶聯(lián)型 中期合成型 部分生長偶聯(lián)型延續(xù)合成型 非生長偶聯(lián)型 滯后合成型第47頁第47頁1. 生長偶聯(lián)型（又稱同時合成型） 酶生物合成與細胞生長同時。特點：酶合成能夠誘導，但不受分解代謝物阻遏和反應產(chǎn)物阻遏。 當清除誘導物、細胞進入平衡期后，酶合成馬上停止，表明這類酶所相應mRNA很不穩(wěn)定。第48頁第48頁生長偶聯(lián)型中特殊形式中期合成型 酶合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶合成也伴隨停止。特點：酶合成受產(chǎn)物反饋阻遏或分解代謝物阻遏。 所相應mRNA是不穩(wěn)定。 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線 第49頁第49頁2

19、.部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型） 酶合成在細胞生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還能夠延續(xù)合成較長一段時間。特點：可受誘導，普通不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。 所相應mRNA相稱穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線第50頁第50頁3. 非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型） 只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物阻遏作用。 所相應mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 第51頁第51頁總結：影響酶生物合成模式主要原因 高：可在細胞停止生長后繼 1）mRNA穩(wěn)定性 續(xù)合成酶 差：伴隨細胞停止生長而終 止酶合成 2）培養(yǎng)基中阻遏物存

20、在 不受阻遏：伴隨細胞生長而開始酶合成。 受阻遏：細胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始 合成。第52頁第52頁 酶生產(chǎn)中最抱負合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長久和產(chǎn)酶期顯著差異。細胞開始生長就有酶產(chǎn)生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還能夠繼續(xù)生成一段時間。 對于：同時合成型：提升對應mRNA穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵 溫度 。滯后合成型：盡也許降低甚至解除分解代謝物阻遏，使 酶合成提早開始。中期合成型：要在提升mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方 面努力。第53頁第53頁(二) 產(chǎn)酶動力學普通產(chǎn)酶動力學方程可表示為：式中 X細胞濃度(g /L) 細胞比生長速率(h-1) 生長偶聯(lián)比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)

21、 非生長偶聯(lián)比產(chǎn)酶速率(IU/(gh) E酶濃度(IU/L) t時間(h)第54頁第54頁生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型 非生長偶聯(lián)型 第55頁第55頁 第三節(jié) 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶 一、產(chǎn)酶微生物分離和選育 1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應具備條件 （1）酶產(chǎn)量高 （2）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低） （3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化 （4）易分離提純 （5）安全可靠（不是致病菌）第56頁第56頁2.慣用產(chǎn)酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAs

22、pergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida第57頁第57頁 3. 產(chǎn)酶微生物分離和篩選 1)樣品采集:從富含該酶作用底物場合采集樣品 2)富集培養(yǎng): 投其所好，取其所抗 3)分離取得微生物純培養(yǎng)（pure culture）。 4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)復篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高菌株，以質為主。 第58頁第58頁 -淀粉酶篩選第59頁第59頁蛋白酶產(chǎn)生菌取得辦法應用含酪蛋白培養(yǎng)基第60頁第60頁4.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種選育

23、誘變育種 原生質體融合育種 基因工程育種 第61頁第61頁 二.微生物發(fā)酵產(chǎn)酶辦法 1.固體培養(yǎng):尤其適合于霉菌培養(yǎng) 2.液體培養(yǎng):當前酶發(fā)酵生產(chǎn)主要方式 3.固定化細胞 :需要特殊固定化細胞反應器 第62頁第62頁三.微生物酶類型 1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中大分子而釋放到細胞外，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到調整控制少。 2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細胞內(nèi)發(fā)揮作用酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物調控。第63頁第63頁酶發(fā)酵生產(chǎn)普通工藝流程 第64頁第64頁第四節(jié) 動、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 與微生物細胞相比，動物細胞和植

24、物細胞含有各自不同特性，需采取各自不同培養(yǎng)工藝。 第65頁第65頁動物細胞模式圖第66頁第66頁植物細胞結構第67頁第67頁 植物、動物、微生物細胞特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um20030011010100倍增時間/h120.3-615營養(yǎng)要求簡樸簡樸復雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等第68頁第68頁三者之間差別主要有：植物細胞動物細胞微生物細胞。動物細胞、植物細胞生產(chǎn)周期比微生物長。植物細胞和微生物細胞營養(yǎng)要求較簡樸。植物細胞生長以及次級

25、代謝物生產(chǎn)要求一定光照。植物細胞和動物細胞對剪切力敏感。植物、微生物和動物細胞主要目的產(chǎn)物各不相同。第69頁第69頁一、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1.植物細胞培養(yǎng)特點 2.培養(yǎng)基特點 應用最廣是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基是1962年由Murashinge和Skoog為煙草細胞培養(yǎng)而設計培養(yǎng)基。LS培養(yǎng)基是在其基礎上演變而來。第70頁第70頁3.培養(yǎng)辦法：懸浮細胞培養(yǎng)細胞株建立；外植體與愈傷組織擴大培養(yǎng)；大罐培養(yǎng)；第71頁第71頁外植體： 從植株取出，通過預處理后，用于植物組織培養(yǎng)植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子等）片段或小塊。愈傷組織： 將上述外植體植入誘導培養(yǎng)基中，于25左右培養(yǎng)一段時間，從外植體切口部位長出小細胞團。第72頁第72頁水稻外植體（幼胚）和愈傷組織外植體愈傷組織第73頁第73頁4. 培養(yǎng)條件影響與控制（1）溫度（2）pH（3）通氣與攪拌（4）光照控制（5）前體添加（飼喂）（6）誘導子（elicitors）應用第74頁第74頁5.植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例 以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例(1)大蒜愈傷組織誘導 選取堅固、飽滿、無病蟲害大蒜蒜瓣，清除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后