放射性免疫藥盒(本科課程,)

1、2021/9/131第七章 放射免疫分析試劑盒的制備一、概要二、放射免疫分析試劑盒主要組分的制備技術(shù)三、典型放射免疫分析試劑盒的制備四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展2021/9/132 放射性同位素在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 相機(jī) 1 體內(nèi)診斷（核醫(yī)學(xué)影像學(xué)) SPECT PET 2 治療（放射治療藥物、種子源） 3 體外檢測(cè)（放射免疫分析） 2021/9/133一、 概要概要概念與原理主要的放射標(biāo)記免疫分析方法放射標(biāo)記免疫分析方法的特點(diǎn)2021/9/134放射免疫分析技術(shù)（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測(cè)量的高靈敏性而建立的一種超微量分析方法，能夠定量檢測(cè)生物體內(nèi)成百上千種活性物質(zhì)，是現(xiàn)代生物、醫(yī)學(xué)和臨床診

2、斷的重要手段。1 概念與原理 以放射性核素（主要為125I, 57Co, 3H, 14C等）標(biāo)記抗原，抗體，配基或受體，在體外條件下，經(jīng)過(guò)不同的結(jié)合反應(yīng)（競(jìng)爭(zhēng)或非競(jìng)爭(zhēng)性的），再將結(jié)合和未結(jié)合的標(biāo)記物分開(kāi)，測(cè)量其放射性活度，從而計(jì)算各種生物活性物質(zhì)的含量。 基本原理2021/9/135 抗原(Antigen)：能刺激動(dòng)物機(jī)體的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與其發(fā)生特異性反應(yīng)（結(jié)合）的物質(zhì)。一般為異種或異體物質(zhì)（即機(jī)體的免疫活性細(xì)胞從未接觸過(guò)的異物）。 完全抗原：具有上述兩種特性，即單獨(dú)能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，又能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合生成抗原-抗體復(fù)合物。

3、大多為大分子量的蛋白質(zhì)。 半抗原(Half Antigen, Hapten)：?jiǎn)为?dú)不能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，但能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞起特異性結(jié)合反應(yīng)生成抗原-抗體復(fù)合物的物質(zhì)。與載體結(jié)合后注入動(dòng)物體內(nèi)能誘導(dǎo)抗體形成，即成為完全抗原。2021/9/136抗體(Antibody)：由抗原誘導(dǎo)形成的一種血清球蛋白，與抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。特異性(Specificity)：抗體抗原反應(yīng)具有特異性，即一種抗體（抗原）只能與相應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合，不能與其它無(wú)關(guān)的抗原（抗體）結(jié)合。哺乳動(dòng)物IgGIgAIgM人體IgGIgAIgMIgDIgE2021/9/137主要的放射免疫分析

4、方法放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA） 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA） 受體放射性配體結(jié)合分析（Receptor Radio-ligand Bonding Assay, PRLBA） 放射受體分析（Radio-Receptor Assay, RRA）2 主要的放射標(biāo)記免疫分析方法2021/9/138 1958-1960年由Yalow RS and Breson SA創(chuàng)建，為最早的放射標(biāo)記免疫分析方法。（1977年獲得了諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）。 原理：用放射性核素標(biāo)記抗原，標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物（如抗體）上有限的結(jié)合

5、位點(diǎn)。然后將結(jié)合與未結(jié)合的游離抗原分離，測(cè)定其放射性分布，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中待測(cè)物的含量。1) 放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA）Ag* +Ag+ Ab Ag*-Ab + Ag-Ab游離物（F） 復(fù)合物（B）2021/9/139對(duì)于RIA，應(yīng)滿足以下條件： 抗原是純一的，只由一種化學(xué)成分組成； 抗體也僅由一種化學(xué)成分組成； 抗原與抗體均為單價(jià)，即一分子抗原只能和一分子抗體反應(yīng)； 標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗原具有相同的物理-化學(xué)性質(zhì)； 抗原-抗體反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律； 反應(yīng)達(dá)到平衡； 結(jié)合抗原和未結(jié)合的游離抗原能完全分開(kāi)，且不破壞反應(yīng)平衡； 能準(zhǔn)確測(cè)量結(jié)合抗原和游離抗原之比，

6、或結(jié)合抗原與總抗原之比。2021/9/1310K1Ag + Ab AgAb k-1 K（親和常數(shù)）= =(AgAb）/ Ag Ab k-1 b/f =（AgAb）/ ( Ag)=K(Ab) b/f=K(AbT-B)K12021/9/1311 放射免疫分析的Scatchard圖2021/9/13122) 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA） 在RIA基礎(chǔ)上建立起來(lái)的標(biāo)記免疫分析方法。原理：用放射性核素標(biāo)記抗體，以過(guò)量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合建立的方法. 免疫放射量度分析原理示意圖2021/9/1313 IRMA劑量反映曲線 RIA反映曲線2021/9/131

7、4RIA與IRMA反應(yīng)式比較方法反應(yīng)式分離方法RIAAg* +Ag+ Ab Ag*-Ab + Ag-Ab（定量抗體）液相分離固相分離IRMAAg+ Ab* Ag-Ab* + Ab*Ag +Ab*+固相Ab 固相Ab-Ag-Ab* +Ab*（過(guò)量抗體）免疫吸附劑或固相分離RIA與IRMA的工作原理主要區(qū)別RIAIRMA1 競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合分析2 反應(yīng)體系中有抗原、標(biāo)記抗原和抗體3 標(biāo)記抗原4 在標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量反應(yīng)體系中結(jié)合率越大，劑量越小，反之，則越大5 免疫結(jié)合反應(yīng)慢1 非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合分析2 反應(yīng)體系中有固相抗原、抗原與標(biāo)記抗體3 標(biāo)記抗體4 在標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量反應(yīng)體系中隨結(jié)合率增高劑量值也隨之增大

8、5 免疫結(jié)合反應(yīng)快2021/9/1315特點(diǎn)特異性很強(qiáng)，即使化學(xué)結(jié)構(gòu)很接近；靈敏度高，可達(dá)10-14mol/L;精確度較高，放射性活度探測(cè)不易受干擾；應(yīng)用范圍較廣，適用于多種化學(xué)結(jié)構(gòu)；操作簡(jiǎn)單，分析速度快，樣品不需預(yù)處理。3 放射標(biāo)記免疫分析方法的特點(diǎn)2021/9/1316主要組分標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)品抗血清分離劑質(zhì)控血清二、放射標(biāo)記免疫試劑盒主要組分的制備技術(shù)2021/9/1317（一）標(biāo)記物的制備技術(shù)核素半衰期衰變方式及分支比主要射線及能量(keV, %) 生產(chǎn)方式3H12.3y-(100)- 18.61(100)6Li(n, a)3H14C5730y+(99.8)EC(0.2) - 155(100

9、)14N(n, p)14C35S87.5d-(100)- 167.4(100)35Cl(n, p)35S57Co271.8dIT(100) 122(85.5)56Fe(d, n) 57Co75Se119.8dEC(100) 136(58)74Se(n, r)75Se125I60.1dEC(100) 28-35124Xe(n, r)125Xe 125I 可用于放射免疫分析的放射性核素射線易于探測(cè)半衰期適中易于標(biāo)記2021/9/1318蛋白質(zhì)的I標(biāo)記直接氧化親電法間接標(biāo)記法氯胺T法（Chloramine-T, Ch-T）酶促標(biāo)記法Iodogen(氯甘尿法)Bolton-Hunter（BH）方法 其

10、它間接標(biāo)記法 1 125I的標(biāo)記2021/9/13192 標(biāo)記物的分離純化分離純化方法離子交換色譜法凝膠色譜(Sephadex)法薄層色譜法高效液相色譜(HPLC)2021/9/13203 標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定質(zhì)量評(píng)價(jià)參數(shù)核素(125I)利用率放化純(85%)比活度(80%)免疫活性(過(guò)量抗體結(jié)合率)4 標(biāo)記物的穩(wěn)定性及貯存條件多肽類(lèi)標(biāo)記物通常采用冷凍干燥方法貯存;小分子化合物及單抗標(biāo)記物可以液體狀態(tài)貯存;標(biāo)記物通常在2-8條件下保存，有效期約周。2021/9/1321（二）抗原和抗體的制備技術(shù)免疫原（抗原）的制備免疫原的制備采用生化技術(shù)提取(人體器官或體液）采用偶聯(lián)技術(shù)制備親和層析法分子篩法離子

11、交換法高效液相色譜法2021/9/13222 抗體制備抗體多克隆抗體單克隆抗體 動(dòng)物種屬選擇動(dòng)物家兔綿羊豚鼠等2021/9/1323 免疫增強(qiáng)劑注射方式皮內(nèi)注射皮下注射腹腔注射靜脈注射 凡可增強(qiáng)被免疫動(dòng)物免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為免疫增強(qiáng)劑， 其種類(lèi)眾多。 免疫注射部位背部腹股溝足墊2021/9/1324抗血清的質(zhì)量鑒定質(zhì)量鑒定親和性特異性滴度抗體貯存抗血清加入0.1%-0.2%防腐劑，按需要量分裝、凍干，-50貯存。2021/9/1325（三）單克隆抗體的制備 1975年由Kohler和Milsten采用雜交瘤技術(shù)第一次獲得。 基本原理：利用動(dòng)物脾細(xì)胞即淋巴細(xì)胞可以分泌特異抗體，而骨髓瘤能夠

12、在體外連續(xù)培養(yǎng)的性質(zhì)，將兩種細(xì)胞在融合劑（通常為PEG）的作用下進(jìn)行融合，獲得既可分泌特異抗體又可在體外連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞。因此，這種雜交瘤細(xì)胞就能在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生大量單一類(lèi)型的高純度抗體。 單克隆抗體是僅由一種類(lèi)型的細(xì)胞制造出來(lái)的抗體，對(duì)應(yīng)于多克隆抗體/多株抗體由多種類(lèi)型的細(xì)胞制造出來(lái)的一種抗體。 2021/9/1326小鼠免疫細(xì)胞融合篩 選克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)注如小鼠誘發(fā)腹水單克隆抗體制備過(guò)程質(zhì)量鑒定抗體滴度親和常數(shù)交叉反應(yīng)免疫球蛋白類(lèi)型、亞類(lèi)2021/9/1327特 點(diǎn)高度勻質(zhì)性高度特異性來(lái)源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)缺點(diǎn)熱穩(wěn)定性較差親和性較低價(jià)格較高與多克隆抗體比較2021/9/1328（四）分

13、離劑 分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結(jié)合部分進(jìn)行有效的分離，直接影響RIA測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。分離劑PR試劑(雙抗體與聚乙二醇 沉淀法)磁性分離劑試管固相法分離效果好操作簡(jiǎn)便易于大批量自動(dòng)化分析2021/9/1329（五）標(biāo)準(zhǔn)品與參考血清的制備1 標(biāo)準(zhǔn)品要 求與被測(cè)物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和免疫活性來(lái)源充足、價(jià)格便宜穩(wěn)定、均勻一致量值準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)純品制備（被測(cè)物質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚、可用化學(xué)方法合成）類(lèi)似物制備（被測(cè)物質(zhì)結(jié)構(gòu)不確定、難以用化學(xué)方法合成）2021/9/13302 參考血清 一般含一個(gè)或幾個(gè)分析物，是免疫分析中用來(lái)比較和評(píng)價(jià)不同測(cè)定系統(tǒng)的偏倚和重復(fù)性的血清，也是用于內(nèi)部或外部質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要

14、試劑。作用計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差（批內(nèi)、批間精密度）分析誤差原因并進(jìn)行處理監(jiān)督放免試劑盒穩(wěn)定性判斷分析數(shù)據(jù)可靠性要求與待測(cè)物質(zhì)相近配制的濃度應(yīng)在測(cè)定的工作范圍之內(nèi)（配制高、中、低三種劑量水平）穩(wěn)定、數(shù)量能滿足較長(zhǎng)時(shí)間使用2021/9/1331（六）數(shù)據(jù)處理與分析方法的有效性評(píng)估評(píng)估的內(nèi)容特異性靈敏度精密度準(zhǔn)確性健全性穩(wěn)定性非特異結(jié)合最大結(jié)合2021/9/1332三、幾種典型放射免疫分析試劑盒的制備（一）甲狀腺素放射免疫分析試劑盒的制備（二）游離甲狀腺素FT4試劑盒的制備（三）人血清促甲狀腺激素免疫放射分析試劑盒的制備2021/9/1333四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展國(guó)際市場(chǎng)市場(chǎng)規(guī)模接近300億美元，近期每年

15、增長(zhǎng)率在7-9%左右。特點(diǎn) 檢測(cè)品種多，達(dá)近千種，并且還在持續(xù)增加； 同一公司有多個(gè)產(chǎn)品技術(shù)平臺(tái)；多種免疫分析方法并存，相互競(jìng)爭(zhēng)，相互補(bǔ)充； 大公司產(chǎn)品系列全，小公司產(chǎn)品有特色； 高度集成、自動(dòng)化的儀器診斷與簡(jiǎn)單、快速便于普及的快速診斷。2021/9/1334國(guó) 內(nèi) 200余廠家； 北京北方生物技術(shù)研究所 濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司 北京科美東雅生物技術(shù)有限公司 原子高科股份有限公司 100余種系列產(chǎn)品； 市場(chǎng)規(guī)模40億元（國(guó)內(nèi)與國(guó)外各占一半）； 年增長(zhǎng)率10-16%；2021/9/1335面臨的挑戰(zhàn) 酶免疫分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 時(shí)間分辨熒光免疫分析 (Time-resolved Fluoroimmunoassay, TRF) 化學(xué)發(fā)光免疫分析 (Chemiluminesent immunoassay, CLIA）2021/9/1336放射免疫分析和非放射免疫分析技術(shù)性能比較種類(lèi)RIAELISATRFIACLIA示蹤