高效液相色譜法應(yīng)用講座PPT

1、關(guān)于高效液相色譜法應(yīng)用講座第一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HPLC實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)知HPLC操作操作流程流動(dòng)相的配制色譜柱使用與維護(hù)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理第二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1 概述 定義 分離模式與主要分離機(jī)制基本術(shù)語(yǔ) 正相與反相色譜 HPLC的特點(diǎn) 問(wèn)題思考 第三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定義HPLC用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。第四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介儀器組成根據(jù)需要配置流動(dòng)相在線(xiàn)脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)等。第五張，PPT共九十三

2、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月泵輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)0.5%，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.110 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min；輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150300kg/cm2；液缸容積??；密封性能好，耐腐蝕。 第六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，常用的方法是濾過(guò)，輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。 流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其

3、是在停泵過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。 溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完。 輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。第七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月附：高效液相色譜儀流程圖1貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2高壓泵（輸液泵）3進(jìn)樣裝置4色譜柱分離5檢測(cè)器分析6廢液出口或組分收集器 7記錄裝置泵第八張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.2 HPLC分離模式與主要分離機(jī)制分離模式主要保留機(jī)制液-固吸附吸附劑的表面吸附鍵合相溶質(zhì)在兩相間的分配或溶質(zhì)與極性固定相的吸附離子交換溶質(zhì)離子與填料上的反電荷層之間的相互作用離子對(duì)電中性離子對(duì)在兩相間的分配分子排阻基于流

4、體動(dòng)力學(xué)體積的過(guò)濾作用手性溶質(zhì)手性異構(gòu)體與填料手性作用點(diǎn)間非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體相互作用。親和溶質(zhì)與固定化配體間生化專(zhuān)屬結(jié)合第九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正相色譜法與反相色譜法 正相色譜法反相色譜法 第十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正相與反相 正相色譜法 反相色譜法固定相極性高中 中低流動(dòng)相極性低中 中高組分洗脫次序極性小先洗出 極性大先洗出第十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正相：流動(dòng)相極性，洗脫能力，k ，組分tR反相：流動(dòng)相極性，洗脫能力，k，組分tR第十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.3特點(diǎn)適用范圍寬：現(xiàn)在絕大部分化學(xué)類(lèi)藥品皆可采用該儀器

5、分析。 分離效率高：復(fù)方分析、輔料干擾時(shí)等情況下，更顯示其威力。 速度快：一般出峰時(shí)間均在30min以?xún)?nèi)。第十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月靈敏度高：可檢測(cè)物質(zhì)達(dá)10-9g左右，一般最低檢測(cè)濃度均可達(dá)10-110-3g/ml（進(jìn)樣體積1020l）。并可通過(guò)使用不同的檢測(cè)器，測(cè)定不同物質(zhì)，或再提高測(cè)定靈敏度。第十四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱可反復(fù)使用：一般保存好，均可達(dá)2年以上。 流出的組分容易收集：可用于制備色譜或價(jià)格極為昂貴的物質(zhì)收集。第十五張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 安全：僅有一些有機(jī)溶劑的污染（使用時(shí)，流動(dòng)相口要密封，一者以免揮發(fā)，流動(dòng)

6、相中各組分比例不準(zhǔn)，二者防止揮發(fā)，污染環(huán)境），比氣相要安全的多。 第十六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.4 思考1、為什么說(shuō)分離度與重復(fù)性是系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)指標(biāo)中是更具有實(shí)用意義的參數(shù)？2、影響柱效的因素有哪些？3、影響分離度的因素有哪些？4、影響重復(fù)性的因素有哪些？Rs儀器第十七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響分離的因素1 第十八張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月思考 psi、bar、Mpa如何換算？乙醇為什么不常用作流動(dòng)相？第十九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、HPLC操作操作流程開(kāi)機(jī) 最后開(kāi)檢測(cè)器配制流動(dòng)相流動(dòng)相平衡，在此過(guò)程和適當(dāng)時(shí)候調(diào)節(jié)

7、柱溫、流速、流動(dòng)相比例。必要時(shí)要選柱子。配制對(duì)照品、樣品溶液。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)進(jìn)樣數(shù)據(jù)處理關(guān)機(jī) 先關(guān)檢測(cè)器，后沖洗第二十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流動(dòng)相的配制流動(dòng)相應(yīng)具有的特點(diǎn)流動(dòng)相脫氣流動(dòng)相過(guò)濾除去微粒流動(dòng)相貯存流動(dòng)相極性與截止波長(zhǎng)流動(dòng)相調(diào)pH值思考題第二十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。 b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。 c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命

8、(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。第二十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。 e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。第二十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流動(dòng)相為什么要脫氣流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線(xiàn)的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)

9、造成熒光猝滅。 第二十四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用的脫氣方法比較氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。第二十五張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用的脫氣方法比較超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線(xiàn)真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線(xiàn)脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。第二十六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6

10、月壓力、溫度與氣泡壓力減少時(shí)要產(chǎn)生氣泡溫度升高時(shí)要產(chǎn)生氣泡第二十七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月防止產(chǎn)生新的氣泡沿管壁緩緩倒入先混合后脫氣 梯度洗脫預(yù)先“部分混合”第二十八張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月為什么要濾除微粒為什么溶劑和樣品要過(guò)濾? 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。要正確選用濾膜第二十九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容

11、器中。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過(guò)。第三十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流動(dòng)相的貯存容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現(xiàn)象。第三十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6，流動(dòng)相常用溶劑的極性和截止波長(zhǎng) 由極性可以看出，在反相色譜中，要使出峰時(shí)間加快，可增加流動(dòng)相中的乙腈比例，但要注意分離度的減??；若要使出峰時(shí)間減慢，

12、可增加流動(dòng)相中水的比例，增加水的比例還會(huì)引起分離度的增加；兩者之間綜合來(lái)考慮。四氫呋喃使用時(shí)注意波長(zhǎng)。必須選用色譜級(jí)的。 第三十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 由于甲醇的極限波長(zhǎng)為210nm左右，故短波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，最好不要采用甲醇，而用乙腈。 樣品稀釋用溶劑的選擇：測(cè)定有關(guān)物質(zhì)時(shí)最好選用流動(dòng)相，避免以溶劑峰的干擾，水往往出倒峰。各溶劑截止波長(zhǎng)第三十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流動(dòng)相的pH值 采用反相色譜法分離弱酸（3pKa7）或弱堿（7pKa8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱(chēng)為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于

13、弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。第三十四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱(chēng)為減尾劑或除尾劑。第三十五張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流動(dòng)相的配制緩沖鹽溶液 濃度不要配錯(cuò) ，

14、臨用新配 調(diào)PH時(shí)一般在水相調(diào)，當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相比例較高時(shí)無(wú)法調(diào)。第三十六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月思考題1、流動(dòng)相流速與組成與保留時(shí)間的關(guān)系如何？2、流速與柱效、峰面積的關(guān)系3、乙腈與甲醇在應(yīng)用上的區(qū)別。4、水與有機(jī)相混合比例不同，會(huì)引起粘度變化嗎？5、流動(dòng)相有時(shí)為什么要調(diào)pH？6、流動(dòng)相配好后可用多長(zhǎng)時(shí)間？第三十七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱的使用與維護(hù)閱讀說(shuō)明書(shū)安裝時(shí)注意方向如何排氣泡？反相柱C-18或C8當(dāng)用含緩沖鹽或表面活性劑的流動(dòng)相后，要沖洗干凈。第三十八張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱的使用與維護(hù)色譜柱不用、存放時(shí)，兩頭柱塞一定

15、塞住，防止柱內(nèi)溶劑揮干,否則容易揮發(fā)干損傷柱子。分析生化樣品、血液制品和手性色譜柱時(shí)，最好加一預(yù)柱以保護(hù)。流動(dòng)相極性及流速（壓力）不要突變。第三十九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）色譜柱不能夠碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震蕩；安裝時(shí)，一定要保證閥件或管路的清潔。（2）盡量不使用或少使用高粘度的流動(dòng)相。（3）在滿(mǎn)足靈敏度的情況下，盡可能使用小進(jìn)樣量。如果樣品比較“臟”，要進(jìn)行凈化或提純處理。第四十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月柱溫控制柱溫箱的作用：1、保留時(shí)間精確再現(xiàn)2、提高分離效率3、對(duì)高分子化合物或黏度大的樣品，分析時(shí)柱溫必須高于室溫。4、對(duì)一些具有生物活性的生物分子，要求低

16、的柱溫第四十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月系統(tǒng)平衡1.除上所述外，流動(dòng)相配制時(shí)還需注意什么？2.流動(dòng)相沖洗多長(zhǎng)時(shí)間平衡？如何平衡？3.有表面活性劑時(shí)小流速過(guò)夜，再到規(guī)定流速30min。4.基線(xiàn)什么情況下才算平衡？第四十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月配制樣品和對(duì)照品溶液2配制：溶劑；容器：塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會(huì)被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收。3 對(duì)照品稱(chēng)量問(wèn)題第四十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月預(yù)試預(yù)試目的n，R是否符合要求；保留時(shí)間是否合適調(diào)節(jié)

17、色譜條件流動(dòng)相組成流速柱溫柱子 第四十四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mlmin，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8mlmin為佳。 當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。 第四十五張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流速和柱溫均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)測(cè)定的需要。如含量測(cè)定時(shí)，可適當(dāng)加大流速和提高柱溫；改變柱溫和流速降低均可提高

18、分離效果。第四十六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一次測(cè)定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長(zhǎng)時(shí)間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)才洗脫出來(lái)，確定是否會(huì)影響主峰的測(cè)定。第四十七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10ul而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ul、20ul和50ul），因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致。（可改變樣液濃度）第四十八張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)含量測(cè)定對(duì)照品2份,樣品2 份;有關(guān)物質(zhì),對(duì)照品一份,樣

19、品一份。每份對(duì)照品進(jìn)樣三次，計(jì)算RSD%。系統(tǒng)適應(yīng)性符合要求后，再進(jìn)樣。或者一份對(duì)照品先進(jìn)5針，計(jì)算RSD%符合要求，實(shí)驗(yàn)過(guò)程或?qū)嶒?yàn)結(jié)束進(jìn)另一份對(duì)照品核對(duì)，范圍應(yīng)在98%102%之間第四十九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣品測(cè)定含量測(cè)定樣品2 份，每份1針;有關(guān)物質(zhì)樣品1份, 每份2針。為了考察系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的穩(wěn)定性。適當(dāng)間隔再進(jìn)標(biāo)樣核對(duì)。有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)，空白應(yīng)進(jìn)1針。含量測(cè)定可不做。自身對(duì)照進(jìn)幾針？第五十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月10.3應(yīng)盡量保持樣品溶液和對(duì)照品溶液使用同一溶劑。含量測(cè)定時(shí)一般可以做到，溶出度測(cè)定時(shí)，往往有所差異，通過(guò)先濃配后，再用該溶劑稀釋的

20、辦法進(jìn)行，比例盡可能小。第五十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月儀器沖洗如何沖洗 一般溶劑緩沖梯度第五十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月檢測(cè)器類(lèi)型 最通用的紫外檢測(cè)器：注意測(cè)定波長(zhǎng)較短時(shí)，基線(xiàn)有可能會(huì)飄；洗柱子時(shí)，盡量關(guān)閉光源，以延長(zhǎng)使用壽命。 二極管陣列檢測(cè)器：目前使用者越來(lái)越多。用于多波長(zhǎng)檢測(cè)、峰純度測(cè)定、對(duì)被測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行紫外掃描后選擇波長(zhǎng)等用途。 第五十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 10. 二極管陣列檢測(cè)器的應(yīng)用 采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行論證，也是目前常采用的一個(gè)強(qiáng)有力的手段。它通過(guò)對(duì)一個(gè)色譜峰的數(shù)點(diǎn)進(jìn)行紫外掃描，然后比較所得到的掃描圖譜的接近程度從

21、而評(píng)價(jià)被檢測(cè)峰的純度。 第五十四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月利用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行峰純度檢查的缺點(diǎn)： （1）雜質(zhì)濃度低，或與主成分相比吸收太小，達(dá)不到檢測(cè)靈敏度，無(wú)法檢測(cè)出來(lái)。 （2）當(dāng)雜質(zhì)的發(fā)色團(tuán)與主成分一致，或者說(shuō)雜質(zhì)與主組分有相同或幾乎相同的光譜圖且具相近的流出時(shí)間，此時(shí)雜質(zhì)也無(wú)法發(fā)現(xiàn)。第五十五張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光檢測(cè)器：靈敏度更高，對(duì)那些g級(jí)的制劑品種，有時(shí)適用。但缺點(diǎn)是，基線(xiàn)穩(wěn)定需平衡時(shí)間較長(zhǎng)。 示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)檢測(cè)器）等。第五十六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月檢測(cè)最小峰面積的設(shè)定峰純度的測(cè)定自

22、身對(duì)照法與歸一化法的區(qū)別結(jié)果計(jì)算第五十七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月8定量分析8.1 外標(biāo)法：計(jì)算公式： 使用時(shí)應(yīng)注意盡量保持樣品溶液和對(duì)照品溶液濃度相同 第五十八張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 8.2 內(nèi)標(biāo)法：計(jì)算公式： 第五十九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月8.3 歸一化法和自身對(duì)照法：為有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)）的測(cè)定方法。這是通過(guò)峰面積的比較來(lái)推算出各物質(zhì)質(zhì)量比例的方法。目前多采用自身對(duì)照法來(lái)進(jìn)行。 (1)歸一化法：即一個(gè)峰的峰面積（雜質(zhì)峰）占總峰面積或占主峰面積的多少。由于有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)，總峰面積的絕大部分均為主峰面積，故兩者結(jié)果差不多，結(jié)果基本一致。第六

23、十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(2)自身對(duì)照法：通常是將供試品溶液稀釋一定倍數(shù)后（通常為100倍）作為對(duì)照溶液（這里對(duì)照溶液與對(duì)照品溶液的區(qū)別需要強(qiáng)調(diào)一下），將其和供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液色譜圖中的每個(gè)雜質(zhì)峰面積，與對(duì)照溶液主成分峰面積進(jìn)行比較或計(jì)算進(jìn)行對(duì)雜質(zhì)的判斷。如比較，直接比峰面積大小，如計(jì)算，則采用公式計(jì)算雜質(zhì)含量 。第六十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月如果該物質(zhì)線(xiàn)性關(guān)系良好，稀釋100倍，峰面積還呈線(xiàn)性的話(huà)，那么，歸一化法和自身對(duì)照法所得結(jié)果基本是一致的（最多差0.02%左右）。但如果稀釋100倍，峰面積不呈線(xiàn)性的話(huà)，那么，歸一化法和自身對(duì)照法所

24、得結(jié)果將有所差異，如此時(shí)采用歸一化法，將得不到較為正確的結(jié)果，因?yàn)榇藭r(shí)，峰面積已不能較為準(zhǔn)確地表示質(zhì)量；而采用自身對(duì)照法，則可避免該情況的發(fā)生，這也是目前推薦采用該法的原因所在。第六十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用紫外檢測(cè)器，一般化合物的線(xiàn)性范圍可達(dá)1106或107，但也有一些測(cè)定物質(zhì)，線(xiàn)性范圍較窄，此時(shí)便需要摸索其范圍，但又不能單純考慮線(xiàn)性范圍，還應(yīng)著重考慮供試品溶液的濃度才是最為重要的。第六十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月制劑測(cè)定中注意事項(xiàng)：1. 紫外鑒別中輔料的干擾，易使最大吸收波長(zhǎng)偏離。2. 含量均勻度 采用先加水浸泡使溶漲，再超聲使崩散，再加有機(jī)溶劑使主

25、藥溶解的辦法進(jìn)行，準(zhǔn)確、可靠、易行。第六十四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 溶出度測(cè)定時(shí)如靈敏度不夠，可通過(guò)加大進(jìn)樣量的辦法解決。 對(duì)照品溶液配制、測(cè)定值偏高、過(guò)濾損失等問(wèn)題一定要注意。4. 含量測(cè)定濃度設(shè)定得盡可能低些。測(cè)定值與投料量的吻合性。色譜條件可與有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)的不一致。第六十五張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5. 有關(guān)物質(zhì)注意輔料的影響，可規(guī)定主峰保留時(shí)間幾倍前的輔料峰不計(jì)。單個(gè)雜質(zhì)的設(shè)定。6 勿需去除薄膜衣、糖衣！第六十六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.5 中國(guó)藥典具體品種存在問(wèn)題舉例：1. 甲硫酸新斯的明注射液 含量測(cè)定采用定氮法；BP同

26、品種采用UV、E值法測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、易行。2. 甲磺酸酚妥拉明及其注射液 含量測(cè)定均采用沉淀法，經(jīng)多次操作后測(cè)定，該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且易造成損失、使結(jié)果偏低；BP和USP同品種均采用氫氧化四丁基銨直接滴定的方法，操作簡(jiǎn)便、易行。第六十七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月克霉唑 含量測(cè)定采用對(duì)照品、容量分析滴定法測(cè)定。但未給出滴定度，故滴定時(shí)不知該選用何種體積的滴定管和大約消耗的體積數(shù)，使試驗(yàn)人員需經(jīng)多次試驗(yàn)進(jìn)行摸索，浪費(fèi)了人力、物力。4. 酮康唑乳膏含量測(cè)定采用有機(jī)溶劑多次提取，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且必造成一定的損失（至少5%）。應(yīng)改為采用甲醇破壞基質(zhì)、溶解主藥后，離心，取上清液直接進(jìn)行HPLC法測(cè)

27、定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，便于操作。第六十八張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5.鹽酸布比卡因注射液含量測(cè)定極為煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；BP和USP同品種采用HPLC法測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、易行。6. 提高辦法，及時(shí)更改、完善!第六十九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月思考：下圖說(shuō)明什么？第七十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月找原因如圖所示：同一份溶液進(jìn)樣兩次。怎么會(huì)多出一個(gè)峰第七十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月同一樣品兩份溶液，各自進(jìn)樣，出現(xiàn)圖示結(jié)果什么原因？第七十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月找原因圖示：上圖為空白溶劑。中圖為樣品溶液。下圖為自身對(duì)照。什么

28、原因？第七十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月主峰不見(jiàn)了右圖為空白溶劑圖譜實(shí)驗(yàn)人員說(shuō)在樣品的圖譜上主峰不見(jiàn)了，怎么回事？第七十四張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提高分離度有什么途徑？增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加選擇性。當(dāng)1時(shí)，R0，無(wú)論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來(lái)改變選擇性：a. 改變流動(dòng)相的組成及pH值；b. 改變柱溫c. 改變固定相。第七十五張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提高分離度有什么途徑？改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組

29、成來(lái)實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k2在110范圍內(nèi)，最好為25，窄徑柱可更小些。 第七十六張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月為什么要梯度洗脫樣品的保留范圍寬樣品分子量樣品中含強(qiáng)保留成份樣品稀溶液的柱上濃縮第七十七張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月梯度洗脫時(shí)應(yīng)注意什么問(wèn)題？要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心第七十八

30、張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來(lái)。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。第七十九張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月梯度洗脫時(shí)應(yīng)注意什么問(wèn)題？混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。第八十張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于

31、2022年6月梯度洗脫時(shí)應(yīng)注意什么問(wèn)題？每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。1.在100%B結(jié)果運(yùn)行一定時(shí)間(2 5個(gè)柱體積)以洗脫干擾物,或在每次分析結(jié)束后,快速自最終B%結(jié)果運(yùn)行一梯度至于100%B并維持一段時(shí)間柱平衡:指用起始流動(dòng)相沖洗色譜柱達(dá)到兩相平衡。在每次進(jìn)樣前，用同方法及時(shí)間平衡色譜柱。方法：510柱體積（715ml，對(duì)150mm4 .6mm）。也可用反梯度平衡穩(wěn)固需讓1030倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。第八十一張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月梯度洗脫時(shí)，基線(xiàn)為什么漂移在梯度洗脫中，基線(xiàn)漂移是常見(jiàn)的，尤其是

32、低檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)更為嚴(yán)重。這是由于A(yíng)和B溶劑UV吸收不同造成的。這種UV吸收相關(guān)的漂移可用吸收匹配法消除。向A溶劑加UV吸收物。注意：用UV低波長(zhǎng)及高靈敏度檢測(cè)時(shí)，運(yùn)行空白試驗(yàn)，在色譜圖中常常會(huì)出現(xiàn)一些“非樣品峰，這些峰來(lái)自流動(dòng)相及污染的色譜系統(tǒng)。第八十二張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與檢測(cè)器有關(guān)的故障及其排除1）流動(dòng)池內(nèi)有氣泡 如果有氣泡連續(xù)不斷地通過(guò)流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會(huì)在基線(xiàn)上出現(xiàn)許多線(xiàn)狀峰，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；第八十三張，PPT共九十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與檢測(cè)器有