m6A甲基化研究方法

1、m6ARNA(m6A爭辯思路及方案設計RNARNA60N6-甲基腺嘌呤N6methyladenosine, m6A)是高等生物mRNAlncRNAsmicroRNA，circRNA,rRNA， tRNAsnoRNA 上都有發(fā)生m6A 修飾. m6A修飾主要發(fā)生在RRACH(Write(Eraser)”和 “讀碼器(Reader”打算1(Writer)“即甲基轉移酶,目前這個復合物的成分有METTL3， METTL14,WTAPKIAA1429ALKBH5FTO消碼器)可逆轉甲基化；m6Am6Am6A讀碼器YTHYTHDF1,YTHDF2,YTHDF3，YTHDC1YTHDC2和核不均一蛋白HN

2、RNP家族HNRNPA2B1和 HNRNP。m6AMETTL3 是早先被鑒定為結合SAMHelaHepG2 細胞中m6Apeaks的削減.METTL3 及其同源蛋白METTL14Nuclear speckle)上，顯示修飾可能和的剪切加工相關.WTAPMETTL3METTL14 二聚體相互作用，并共定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA 剪。而KIAA1429 作為候選的甲基轉移酶復合體的亞基，是整體甲基化進程所必需的2.FTOALKBSRSF2RNApre-mRNA3FTO關，提醒m6A4-6ALKBH5是ALKB家族中被覺察具有去甲基作用的RNase Am6A甲基化腺苷去除甲基而不同于

3、FTO7.ALKBH5和它的去甲基化活性影響生mRNA，且ALKBH5敲除雄性小鼠表現出精子發(fā)生特別，這可能是精子發(fā)生相關基因表達轉變的結果7.m6AmRNA-RNA 相互作用;或被直接由 m6A結合蛋白識別，誘發(fā)后續(xù)反響。目前一類含有 YTH 功能構造域的蛋白被鑒定為 m6A 修飾的結合蛋白.其中YTHDF1, YTHDF2， YTHDF3, YTHDC1YTHDC2的結合蛋白. YTHDF1修飾基因的翻譯,YTHDF2 主要影響修飾基因的降解，而 YTHDC1 結合修飾的基因后影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結合蛋白,參與prmRNA的加工8HNRNPC通過m6A與 RNA結合

4、調控目標轉錄本的豐度和選擇性剪切9.m6A圖 1 m6A10m6A越來越多的證據說明m6A 修飾在哺乳動物中發(fā)揮重要的生物功能。例如，在轉錄后水平上調控RNA 的穩(wěn)定性11、定位1213和翻譯1。Claudio R. 等覺察依靠METTL3的pri-miRNA甲基化，會促進DGCR8microRNA15m6A識別蛋白HNRNPA2B1促進pri-miRNA加工成 pre-miRNA16.另外，環(huán)狀RNAm6ARNA17。m6A中起著重要的作用 ,其調控機制的特別可能與人類疾病或癌癥相關 .目前覺察 m6A 可能會影響精子發(fā)育ALKBH5METTL3,YthdcMETTLFTALKBH5METT

5、LUV誘導的DNA(METTL3， FTO、腫瘤生成YTHDF或轉移METTL14)、干細胞更METTL14)、脂肪分化(FTO)、生物節(jié)律、細胞發(fā)育分化、細胞分裂及其它的一些生命過程。例如,ALKBH5mRNAm(6A 7。METTL3和METTL14增加弱精癥精子的 m6A18， 在生殖細胞中,METTL3m6A精子發(fā)生相關基因的表達和選擇性剪接發(fā)生了轉變19。YTHDC2mRNAYTHDC2YTHDC2有經過偶線期的發(fā)育導致小鼠不育20。在DNA,METTL3 可促進DNAPol 與核酸UVDNAMETTL3UV變,并且對UV25Mettl3缺陷通過影響mRNAm6A修飾,m6ASOCS

6、mRNAmRNAIL7STAT5 活性和T殖和分化，進而抑制腸炎的發(fā)生21METTL14 通過調控pri-miRNA的m6AMiR-126的生成加工，從而抑制肝癌的轉移22。在乳腺癌細胞中，低氧刺激能促進依靠低氧誘導因子 HIF 的 ALKBH5ALKBH5 過表達降低了NANOGmRNA 的m6A 修飾，從而穩(wěn)定mRNANANOG23。 此外， 低氧誘導乳腺癌細胞中依靠ZNF217的NANOG 和 KLF4的mRNAm6AALKBH524,METTL3細胞的生長、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為 m6A 調整器或效應器發(fā)揮作用25。在急性髓細胞白血病AML)患者中，m 6) ATP53m 6

7、 A 調控AML26。此外，FTOAMLmRNAm6水平，調整ASB2RARA甲酸AMLm6A在膠質細胞瘤樣細胞中,ALKBH5lncRNA FOXM1FOXM1premRNAm6A胞的成瘤性2METTL3或METTL14的敲除,能夠轉變m6A的富集和ADAM19的表達，極大地促進了膠質瘤細胞的生長、自我更和腫瘤形成29.2 m6A RNA30m6A 的爭辯方向主要是通過爭辯 m6Am6A 修飾的生物學功能和作用機制:一般通過敲除m6A 酶分子,爭辯下游功能基因分子的表達和m6A介導相關基因特別可變剪切、穩(wěn)定性、翻譯、miRNA 調控)影響細胞表型和功能特征。m6Am6A 修飾圖譜構建及作用機

8、制：通過 m6A 甲基化測序(MeRIPSeq, miCLIP構建疾病細胞模型或者發(fā)病組織的 m6Am6Amotif,peaks,Peak 關聯基因的特征,聯合RNA-seqm6Am6A 爭辯思路m6A 爭辯方案m6A疾病樣本 VS 正常樣本MeRIP-seqRNA-seqm6A 修飾圖譜分析m6A 修飾差異基因分析m6A 修飾特征分析差異表達基因關聯分析方案一MeRIP-PCR、qPCR 驗證m6ATCGA 等數據庫篩選特別表達的m6Avs臨床樣本 qPCR 驗證目標基因腫瘤細胞中干擾目標基因MeRIP-SeqMTT、流式、transwell等檢測細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移篩選下游基因方案二

9、IP/pulldown驗證目標基因通m6A 調控下游基因爭辯案例爭辯案例一 m6Am6ABerulava T, Rahmann Rademacher K, Klein-Hitpass L, Horsthemke B:N6-adenosine methylation in MiRNAs。 PLoS One 2022 ， 10(2：e011843。RNAN6 -腺苷m6AmicroRNAsFTO1C1， FTO2D4 和 FTO3C3m6AFTOmicroRNA,miRNAm6AMeRIPSeq 覺察相當一局部的microRNA 具有m6AmotifmicroRNA達的轉錄后調控的簡單性上增加了一

10、個的層次。1FTO miRNAs爭辯案例二機制爭辯IF=13.2MaJZ， YangF， ZhouCC,LiuF， YuanJH，WangF,WangTT， XuQG,ZhouWP， SunSH:METTL14suppressesthe metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6 -methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing。 Hepatology2022， 652)：529-543。m6Am6A肝癌的調控，作者利用試劑盒檢測覺察m6ARNAm

11、6A 免疫印跡驗證m6A平在肝癌中下調。m6A20m6AMETTL14130METTL14其敲除可增加肝癌轉移。接下來作者爭辯 METTL14 抑制肝癌轉移的機制，由于已有爭辯顯示 m6A 修飾能夠增加 DGCR8 蛋白識別pri-miRNAs，促進miRNAsMETTL14 敲除細胞中檢測miRNAprimiRNAsmiR126METTL14DGCR8RNACLIP 試驗顯示DGCR8m6ARNAMETTL14METTL14m6ADGCR8primiR126。m6AMiR126METTL14METTL14m6AmiR126圖1 METTL14在肝癌中下調圖2 METTL14依靠的m6A通過D

12、GCR8調控miR126加工爭辯案例三(機制爭辯IF=27。4ZhangSZhaoBS,ZhouA,LinK,ZhengSLuZChenYSulmanEP,XieKBoglerOetalm6ADemethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program。 Cancer Cell2022, 31(4)：591606 e596。DNARNAGBM中的調控還尚未清楚。為爭辯m6A 調整可能

13、導致GBMTCGA 數據庫，覺察ALKBH5樣干細胞GSCs中高表達且與GBM 病人不良預后相關，干擾ALKBH5 降低 GSCsGSCsALKBH5ALKBH5m6Am6AseqFOXM1qPCR、WB、免疫熒光、核質分別WB/qPCR、RIPMeRIPALKBH5FOXM1GSCs為爭辯ALKBH5 對FOXM1FOXM1lncRNAFOXM1-ASFOXM1RIP， RNA pull downlncRNA FOXM1-ASALKBH5FOXM1ALKBH5lncRNA FOXM1ASFOXM1GSCsm6A圖 1 ALKBH5m6A1。Fu Y， Dominissini D, Recha

14、vi G, He C： Gene expression regulation mediated through reversiblem(6)ARNAmethylation.NatRevGenet2022，15(5)：293-306。2。 SchwartzS， MumbachMR,JovanovicM,WangT， MaciagK,BushkinGG， MertinsP， TerOvanesyanD， Habib N， Cacchiarelli D et al: Perturbation of m6A writers reveals two distinct classesof mRNA met

15、hylation at internal and 5” sites. Cell Rep2022, 8(1:284296。FTO-dependent demethylation of N6-methyladenosine regulates mRNA splicingand is required for adipogenesis。 CellRes2022,241：1403-1419.FTO-mediated formation of N6-hydroxymethyladenosine and N6formyladenosine in mammalian RNA. NatCommun20224：

16、1798。Dina ， Meyre ，Gallina S, Durand E, KornerAJacobson P, Carlsson LM, KiessWVatinV，Lecoeur C et al： Variation in FTO contributes to childhood obesity and severe adult obesityNatGenet2022，39(6)：724726.Boissel S， Reish O， Proulx K, KawagoeTakaki H, Sedgwick B， Yeo GS, Meyre D， Golzio C，Molinari F, K

17、adhom Net al: Lossoffunction mutation in the dioxygenaseencoding FTO genem6Acauses severe growth retardation and multiple malformations. Am J Hum Genet 2022,85(1):106111。7。 Zheng G, Dahl JA, Niu Y， Fedorcsak P, Huang CM, Li CJ， Vagbo CB, Shi Y， Wang WL， Song SHet al： ALKBH5 is a mammalian RNA demeth

18、ylase that impacts RNA metabolism and mouse fertility. MolCell2022，491):18-29。8。9。10.11.Z， DambergerFF， HallJ， AllainFH， MarisC:Structuralandmechanisticinsights intopolyuridine)tractrecognitionbythehnRNPCRNArecognitionmotif。 JAmChemSoc2022，136(41):14536-14544.C， ParisienM,PanT:N6)-methyladenosine-de

19、pendentRNAstructuralswitches regulate RNA-protein interactions. Nature2022 , 5187540:560-564。Zhao BS， Roundtree IA, He C:Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. NatRevMolCellBiol2022， 181：31-42.Wang X, Lu Z, Gomez A, Hon GC ， Yue YHan DFu YParisien M, Dai QJia G et al:N6methylade

20、nosinedependent regulation of messenger RNA stability. Nature 2022 ，505(7481:117-120。12。 FustinJM， DoiM， YamaguchiY， HidaH,NishimuraS,YoshidaM,IsagawaT， MoriokaMS,KakeyaH,ManabeIetalRNA-methylationdependentRNAprocessingcontrolsthespeedofthecircadianclock。Cell2022，155(4：793-80。13。 Molinie B, Wang J,

21、Lim KS, Hillebrand R， Lu ZX， Van Wittenberghe N， Howard BD， DaneshvarK， Mullen AC， Dedon P et al： m(6A-LAIC-seq reveals the census and complexity of the m(6)A epitranscriptome. NatMethods2022,138)：692-698.14.MeyerKDPatilDP,ZhouJ,ZinovievA， SkabkinMA，ElementoO，PestovaTVQianSB,JaffreySR: 5” UTR m(6)A

22、Promotes Cap-Independent Translation。 Cell2022 ， 1634:999-1010.15。 AlarconCRLeeHGoodarziHHalbergN,TavazoieSFN6methyladenosinemarksprimarymicroRNAsforprocessing. Nature2022 519(7544)：482485.16。 AlarconCR， GoodarziH， LeeHLiuXTavazoieS,TavazoieSFHNRNPA2B1IsaMediatorofm6)ADependent Nuclear RNA Processin

23、g Events. Cell2022 ， 162(6):1299-1308。YangY,FanX，MaoM,SongX,WuP,ZhangY,JinY,ChenLL translationofcircularRNAsdrivenbyN6methyladenosine.CellRes2022,27(：626-641. etal： IncreasedN6methyladenosineinHumanSpermRNAasaRiskFactorforAsthenozoospermia.SciRep2022，6:24345.19。Xu K, Yang ，Feng G， Sun B， Chen JQ, Li

24、 Y， Chen Y， Zhang XX, Wang CX, Jiang Leta: Mettl3mediated m6A regulates spermatogonial differentiation and meiosis initiation. Cell Res 2022。20.HsuPJ,ZhuYMaH,GuoYShiXLiuYQiM,LuZShiHWangJetalYthdc2isanN6-methyladenosine binding protein that regulates mammalian spermatogenesis。 Cell Res2022.m6A21。LiHB

25、,TongJ，ZhuS，BatistaPJ，DuffyEE,ZhaoJ，BailisW，CaoG,KroehlingL,ChenYet al: m6A mRNA methylation controls T cell homeostasis by targeting the IL-7/STAT5/SOCS 。 Nature2022,5487667)：338342。 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6methyladenosinedependent primary Mic

26、roRNA processing。 Hepatology2022, 652:529-543。ZhangC，SamantaD，LuH，BullenJW,ZhangH，ChenI，HeX,SemenzaGL：HypoxiainducesthebreastcancerstemcellphenotypebyHIF-dependentandALKBH5mediatedm6A-demethylationofNANOGmRNA.ProcNatlAcadSciUSA2022，113(14:E20472056.24。 ZhangC,ZhiWI， LuH,SamantaD,ChenI， GabrielsonE,S

27、emenzaGL:Hypoxiainduciblefactorsregulate pluripotency factor expression by ZNF217 and ALKBH5mediated modulation of RNA methylation in breast cancer cells。 Oncotarget2022, 7(40):64527-64542。25。Lin S, ChoeJ,Du P,Triboulet R, Gregory RI: The m6)A Methyltransferase METTL3 PromotesTranslationinHumanCance