離子交換層析

1、第五章 離子交換層析目 的掌握基本原理掌握離子交換劑的分類和性質(zhì)掌握離子交換劑與緩沖掖的選擇掌握離子交換層析的操作第一節(jié) 基本原理 3一、離子交換劑的組成離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)(或功能基團(tuán))和反離子構(gòu)成的 4二、離子交換層析（固定相）的特性 在水中呈不溶解狀態(tài)，但能釋放反離子，同時與溶液中其他離子或離子化合物可逆性結(jié)合，并且結(jié)合后本身的理化性質(zhì)不變?nèi)纾篟A + B+ RB + A+ 或RA + B- RB + A-5三、離子交換層析的原理值是反映離子交換劑對不同離子的結(jié)合力或選擇性的參數(shù) 由于離子交換劑的選擇性，對不同的離子或離子化合物有不同的結(jié)合力，所以用洗脫劑洗脫時，結(jié)合力小的先被洗

2、脫出來，結(jié)合力大的后被洗脫下來，從而達(dá)到分離混合物的目的(離子交換劑的選擇性決定其與溶液中離子的結(jié)合力大小，通常用離子交換劑與溶液中離子的反應(yīng)平衡常數(shù) 表示) =若 1，即RBRA,表示離子交換劑對B+的結(jié)合力比A+ 大若 = 1，即RB=RA,表示離子交換劑對B+的結(jié)合力與A+ 相等若 1，即RBRA,表示離子交換劑對B+的結(jié)合力比A+ 小，當(dāng)A+=B+時，6規(guī) 律強(qiáng)酸性陽離子交換劑對H+的結(jié)合力比對Na+小強(qiáng)堿性陰離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-小得多弱酸性離子交換劑對H+的結(jié)合力比對Na+大弱堿性離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-大 離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力大小，與離子的電

3、荷量成正比，而與水合離子的半徑的平方成反比，其與各種陰、陽離子的結(jié)合力大小排列順序見P717離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力： 與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。二價陽離子：Mg 2+Ca2+Sr 2+Ba2+ (對陽離子交換劑)一價陰離子：F-Cl-Br-I- (對陰離子交換劑)不同價陽離子：Na+Ca2+A13+Ti4+ (對陽離子交換劑)一價陽離子：Ll+Na+K+Rb+Cs+ (對陽離子交換劑)兩性離子的蛋白質(zhì)、酶類、多肽等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力 主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài) 8 對于呈兩性離子的蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等，與離子交

4、換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)及在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH pI時，能被陽離子交換劑吸附；反之pH pI時，能被陰離子交換劑吸附。若在相同的pH條件下，且pI pH 時， pI越高，堿性越強(qiáng)，就越容易被陽離子交換劑吸附 對于呈膠體狀態(tài)的大分子物質(zhì)，一般采用選擇性好的弱酸性離子交換劑，希望其交聯(lián)度小，孔徑大，便于大分子物質(zhì)滲透入網(wǎng)孔中進(jìn)行離子交換反應(yīng)離子交換層析的原理（依據(jù)）：離子交換劑對各種離子或離子化合物有不同結(jié)合力（圖5-2表示離子交換層析的過程）9離子交換層析原理示意圖10第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)11離子交換劑應(yīng)具備的條件有高度的不溶性；而在各種溶劑中進(jìn)行交換時

5、，交換劑不發(fā)生溶解有疏松多孔的結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，能使交換離子在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換有較多的交換基團(tuán)有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，在使用過程中，交換劑不能因物理或化學(xué)因素的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象12一、分 類（一）疏水性離子交換劑 其基質(zhì)是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹脂，呈海綿狀結(jié)構(gòu) 如常用的樹脂聚乙烯苯是以苯乙烯為單體，二乙烯苯為交聯(lián)劑聚合而成；然后在此基礎(chǔ)上，以共價鍵引入電荷基團(tuán)131.陽離子交換劑電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電 強(qiáng)酸型：帶磺酸基團(tuán)的樹脂（R-SO3H）據(jù)電荷基團(tuán)的強(qiáng)弱分為 中強(qiáng)酸型：帶磷酸基團(tuán)或亞磷酸基團(tuán)的樹脂（R-PO3H2） 弱酸型：帶羧基或酚羥基的樹脂（R-C

6、OOH或R-ph-OH）142.陰離子交換劑 即在樹脂中分別引入季胺-N（CH3）3、叔胺-N（CH3）2、仲胺-NCH3和伯胺-NH2基團(tuán)構(gòu)成的 樹脂型離子交換劑一般呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的珠狀體，其大小在20400目之間（目數(shù)越大，顆粒越細(xì)，樹脂的分辨率和交換容量就越高）疏水性離子交換劑由于含有大量的活性基團(tuán)，交換容量高，機(jī)械強(qiáng)度大，流動性好，主要用于分離： 無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質(zhì) 除去蛋白質(zhì)溶液中的表面活性劑 分離某些不易變性蛋白質(zhì)1516（二）親水性離子交換劑 其基質(zhì)是一類天然或人工合成、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)，如纖維素、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)葡聚糖及交聯(lián)瓊脂糖等1.纖維素離子

7、交換劑 以微晶纖維素為基質(zhì)，通過化學(xué)方法引入電荷基團(tuán)構(gòu)成2.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 以交聯(lián)葡聚糖G-25和G-50為基質(zhì)，用化學(xué)方法引入電荷基團(tuán)（表5-5）。這類交換劑的外形呈珠狀，對蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)有較高的結(jié)合容量，而且流速比無定型纖維素離子交換劑快173.瓊脂糖離子交換劑 以交聯(lián)瓊脂糖Cl-6B(Sepharose Cl-6B)等為基質(zhì)，用化學(xué)方法引入電荷基團(tuán) 如：DEAE-Sepharose Cl-6B為陰離子交換劑 CM- Sepharose Cl-6B為陽離子交換劑 這類離子交換劑呈珠狀，網(wǎng)孔大，特別適合分離大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)；即使在流速快的操作條件下，分辨率也較高

8、18二、性 質(zhì)（一）顏色和形狀1.顏色樹脂類離子交換劑：褐色、黃色、乳白色親水性離子交換劑：基本均為白色2.形狀：絕大多數(shù)為珠狀19（二）交聯(lián)度 各種樹脂因其所用的交聯(lián)劑不同，交聯(lián)度（交聯(lián)劑在基質(zhì)中所占的百分?jǐn)?shù)）也各不相同，如：樹脂的交聯(lián)劑二乙烯苯在216%之間等20（三）吸水量和膨脹度 離子交換劑在水溶液中的吸水量或膨脹度與基質(zhì)、電荷基團(tuán)的性質(zhì)，溶液的pH值及離子強(qiáng)度密切相關(guān)1.基質(zhì) 由親水性基質(zhì)構(gòu)成的離子交換劑的膨脹度大，可達(dá)60ml/g干膠；而由疏水性基質(zhì)構(gòu)成的離子交換劑的膨脹度較小；但 總體而言，膨脹度都隨交聯(lián)度的增加而降低212.電荷基團(tuán) 電荷基團(tuán)的電荷強(qiáng)弱對離子交換劑的膨脹度影響極

9、明顯 如 強(qiáng)堿型離子交換劑QAE-SephadexA-50置0.3mol/LNaCl的緩沖液中，其膨脹度（22ml/g干膠粉）比弱堿型離子交換劑DEAE-SephadexA-50的大 電荷基團(tuán)的電荷量一致時，不論帶正電荷或負(fù)電荷，其膨脹度基本相同（如A、C或B、D）223.溶液的離子強(qiáng)度和pH值 當(dāng)離子交換劑帶有同種電荷或解離度最大時，各電荷基團(tuán)之間的排斥力最大，其膨脹度也最大。因此，交聯(lián)度小的離子交換劑處于低離子強(qiáng)度時，其膨脹度比處于高離子強(qiáng)度說大；但交聯(lián)度大的離子交換劑的膨脹度幾乎與離子強(qiáng)度無關(guān)，弱陽離子交換劑的膨脹度隨pH的提高而增大，而弱陰離子交換劑的膨脹度卻是隨pH的降低而增加 離子

10、交換劑在溶液中充分膨脹后，它所帶的電荷基團(tuán)能得到充分暴露，網(wǎng)孔大小達(dá)到穩(wěn)定，這有利于提高交換容量和分辨率23（四）交換容量1.定義：指離子交換劑與溶液中的離子或離子化合物進(jìn)行 交換的能力2.表示方法總交換容量：只與離子交換劑本身有關(guān)有效交換容量：除與離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)外，還與測定條件有關(guān)3.影響交換容量的因素24（1）篩孔 有效交換容量與交換劑篩孔的直徑及分離物的分子量大小密切相關(guān) 當(dāng)離子交換劑的交聯(lián)度較低時，用前先進(jìn)行充分溶脹時，其篩孔會增大，結(jié)果使大分子物質(zhì)能進(jìn)入篩孔與電荷基團(tuán)交換，而且使交換劑的電荷基團(tuán)暴露出來；從而增加有效交換容量 如表5-7：DEAE-Sephadex A-25

11、和DEAE-Sephadex A-50對不同分子量的蛋白質(zhì)的束縛容量 25（2）離子強(qiáng)度 當(dāng)溶液中的離子強(qiáng)度升高時，可降低交換劑的有效交換容量（因?yàn)楦邚?qiáng)度的離子含量會競爭離子交換劑上的束縛位點(diǎn)）這也是用高離子強(qiáng)度的緩沖液作為洗脫劑洗脫被束縛在交換劑上的有效成分的依據(jù)26（3）pH值 對于強(qiáng)離子交換劑而言，在任何pH環(huán)境中都處于解離狀態(tài)，所以交換容量與pH的變化基本無關(guān) 但對于弱離子交換劑而言，其交換容量與溶液的pH密切相關(guān)（因?yàn)槿蹼x子交換劑的電離程度會受到溶液pH 的影響，從而影響電荷基團(tuán)的數(shù)量） 弱陰離子交換劑的交換容量隨著pH值（其pK值）的下降而增大；弱陽離子交換劑的交換容量隨著溶液pH

12、值（其pK值）的上升而增大274.交換容量的測定（1）強(qiáng)酸型陽離子交換劑：測定前，先用一定量酸液使交換劑轉(zhuǎn)變成H型（即可交換離子為H+），然后用蒸餾水洗至中性；用5%NaCl溶液通過交換劑，直至流出液為中性。再用D.W洗凈，合并流出液，以標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至甲基紅終點(diǎn)。由交換劑所消耗的堿量計(jì)算總交換容量（2）中強(qiáng)或弱酸性陽離子交換劑：先將交換劑轉(zhuǎn)變成“H型”，接著將一定量體積的標(biāo)準(zhǔn)液通過適量的H型交換劑后，D.W洗凈，合并流出液，以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定至甲基紅終點(diǎn)（ 回滴過量的NaOH ），由交換劑所消耗的堿量計(jì)算總交換容量28（3）強(qiáng)堿型陰離子交換劑：先將一定量的強(qiáng)堿型陰離子交換劑轉(zhuǎn)換成-OH型

13、，D.W洗至中性后，用5%NaCl通過交換劑直至流出液為中性，D.W洗凈，合并流出液。以標(biāo)準(zhǔn)酸液滴定至甲基紅終點(diǎn)。由交換劑所消耗的酸量計(jì)算總交換容量（4）弱堿型陰離子交換劑：其測定方法同“強(qiáng)堿型陰離子交換劑”29（五）穩(wěn)定性基質(zhì)不同，離子交換劑的穩(wěn)定性有差異樹脂類離子交換劑在較強(qiáng)的酸性或堿性環(huán)境條件下短時間處理仍然穩(wěn)定水溶性離子交換劑在水、鹽、弱酸、弱堿和有機(jī)溶劑環(huán)境中穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化劑和多糖水解酶環(huán)境中不穩(wěn)定；有時還需低溫加抑菌劑（如NaN3）保存。如交聯(lián)纖維素在強(qiáng)堿性環(huán)境下其大分子結(jié)構(gòu)易破壞；瓊脂糖凝膠存放不當(dāng)易染菌等30（六）比 重 離子交換劑的比重隨溶脹溶劑的不同而不同。所以

14、，交換劑經(jīng)D.W溶脹，酸、堿處理后，裝柱之前需用平衡液充分平衡，以免裝柱時出現(xiàn)“上浮”現(xiàn)象31（七）流 速 通常用ml/h或ml/cm2.h表示。離子交換層析的流速一般由交換劑的性質(zhì)、操作壓、層析柱體積和被分離樣品的要求等因素決定。在操作壓和其它層析條件相同的情況下：交換劑的顆粒大，流速就快洗脫液的黏度大，流速就慢樹脂、瓊脂糖和高交聯(lián)度的葡聚糖等離子交換劑（機(jī)械強(qiáng)度高）層析時，其流速與操作壓成正比交聯(lián)度小的葡聚糖離子交換劑用于層析時，其流速與操作壓成拋物線瓊脂糖離子交換劑層析時，流速對分辨率影響不大，因此大量生物樣品的分離用瓊脂糖離子交換劑層析3233第三節(jié) 離子交換劑與緩沖液的選擇34一、離

15、子交換劑的選擇（一）陰陽離子交換劑的選擇依據(jù)被分離組分所帶電荷若帶正電荷，用陽離子交換劑若帶負(fù)正電荷，用陰離子交換劑若為兩性物質(zhì)，則看其在什么pH范圍叫穩(wěn)定如：某pro的pI=5.0，若其在pH58穩(wěn)定，則選擇陰離子交換層析；若其在pH5較穩(wěn)定，則選擇陽離子交換層析35（二）強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇 一般，強(qiáng)性離子交換劑適用范圍廣，常用于制備去離子水和分離在極端pH中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)；而弱性離子交換劑的適用范圍相對較窄，在中性溶液中的交換容量也較高，且用其分離生命大分子物質(zhì)時，不易引起失活。故分離生物樣品時習(xí)慣采用弱性離子交換劑36（三）不同離子型交換劑的選擇 離子交換劑處于電中性時往往帶有一

16、定的反離子，如H型、Na型、NH4型等，使用時，為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子：強(qiáng)酸型陽離子交換劑多選擇H型強(qiáng)堿型陰離子交換劑多選擇-OH型弱酸型陽離子交換劑多選擇Na型弱堿型陰離子交換劑多選擇Cl型37（四）不同基質(zhì)離子交換劑的選擇 常見的幾種不溶性基質(zhì)有樹脂、纖維素、葡聚糖和瓊脂糖。在分離生命大分子物質(zhì)時，一般選擇親水性基質(zhì)（因?yàn)橛捎H水性基質(zhì)制成的離子交換劑對生命大分子物質(zhì)的吸附和洗脫都比較溫和，層析時不會導(dǎo)致被分離物質(zhì)活性喪失）38二、緩沖液的選擇 由于離子交換劑除了可與被分離組分進(jìn)行交換外，還可以與緩沖液中的離子進(jìn)行交換。離子交換劑吸附被分離物的量與緩沖液的pH值及離子

17、強(qiáng)度密切相關(guān)391.已知pI的生物樣品的分離選用的起始緩沖液，其pH和離子強(qiáng)度應(yīng)滿足有效成分與離子交換劑結(jié)合，而雜質(zhì)不能與交換劑結(jié)合。pH值一般應(yīng)比有效成分的pI值高或低1個單位；離子強(qiáng)度為0.1時，就能很快將有效成分與雜質(zhì)分離開也可以選擇緩沖液的離子強(qiáng)度pH值，使有效成分與離子交換劑疏松結(jié)合，而雜質(zhì)與交換劑牢固結(jié)合；然后選用高于初始緩沖液離子強(qiáng)度的緩沖液作為洗脫液，使有效成分解離下來，而雜質(zhì)不解離，達(dá)到分離的目的402.未知pI的生物樣品的分離關(guān)鍵在于了解有效成分的pI起始緩沖液pH的選擇：如圖5-9-A，看哪一管的有效成分完全被吸附起始緩沖液和洗脫緩沖液的確定：分別在10管中加入不同離子強(qiáng)

18、度的緩沖液，經(jīng)洗滌、平衡、加樣、測定含量，繪制曲線等，從圖5-9-B可以看出：當(dāng)小于或等于0.15時，樣品中有效成分基本上全部被吸附；但當(dāng)大于或等于0.3時，有效成分全部留在溶液中。因此起始緩沖液的應(yīng)選擇小于或等于0.15，而洗脫液則選擇大于或等于0.34142三、加樣量的確定 加樣量與離子交換劑的總交換容量大小、對樣品中有效成分的吸附性能、有效成分與雜質(zhì)的比例等有關(guān)在10支裝有相同量離子交換劑的試管中先用相同緩沖液進(jìn)行充分洗滌、平衡分別加入不同量的樣品液吸附完畢，取上清分別測定待分離成分的含量，并繪制圖譜如圖5-9-C，當(dāng)加樣量達(dá)總交換容量的40%時，其吸附力已達(dá)飽和，表明該交換劑中加入樣品

19、液的最大量不應(yīng)超過總交換容量的40%43第四節(jié) 操 作44一、離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型（一）處理D.W浸泡，使充分溶脹加過量D.W懸浮除去細(xì)顆粒酸堿處理45二、再 生1.定義：將使用過的離子交換劑采用適當(dāng)方法使其恢復(fù)原來性能的過程2.方法：一般的交換劑，用酸、堿處理即可對于長期使用，含有很多雜質(zhì)的樹脂，需先用沸水煮，再用酸、堿處理，若含脂溶性雜質(zhì)，還需用EtOH或Me2CO處理對于長期使用的親水性離子交換劑，一般用酸、堿處理即可，使用前D.W漂洗，緩沖液平衡即可46（三）轉(zhuǎn) 型1.定義：將離子交換劑的反離子轉(zhuǎn)換成另一種反離子的過程2.方法：欲使陽離子交換劑 Na型：須用NaOH處理欲使陽離

20、子交換劑 H型：須用HCl處理欲使陽離子交換劑 胺型：須用NH4OH或NH4Cl處理47二、分離物質(zhì)的交換（一）交換方法： 1.柱層析法：也稱為動態(tài)法，即將離子交換劑裝柱，讓樣品液連續(xù)通過交換柱。該法交換效率高，應(yīng)用廣泛2.分批法：也稱為靜態(tài)法，將離子交換劑加入樣品液中，不斷攪拌。該法不能連續(xù)進(jìn)行，但設(shè)備簡單，容易操作48（二）離子交換劑的用量 離子交換劑的用量要視待吸附物質(zhì)的總量和離子交換劑的交換容量而定。當(dāng)樣品中含有多種雜質(zhì)時，必須考慮使交換容量留有充分余地，實(shí)際交換量只能按理論交換量的2550%計(jì)算，當(dāng)樣品雜質(zhì)含量很高或有效成分與雜質(zhì)性質(zhì)相近時，交換劑的用量應(yīng)更高例：交換樹脂用量的計(jì)算（

21、P93）49例: 用717樹脂分離200L含2.2mol量的肌苷溶液時，由于溶液中雜質(zhì)離子的存在，雖然該樹脂的理論交換量為3.5mmol/g，但真正參與交換肌苷的樹脂僅能按7計(jì)算。因此，717樹脂實(shí)際交換肌苷的量為： 3.5mmol量/g7 = 0.25mmol量/g = 0.25mol量/kg，故2.2mol量肌苷全部交換，需717樹脂的量為：=8.8kg 干樹脂50三、洗脫與收集（一）洗脫一般用梯度溶液洗脫梯度洗脫：低 高 pH梯度洗脫：視被分離無而定 對于陽離子交換劑，pH應(yīng)由低 高遞增；而對于陰離子交換劑， pH應(yīng)由高 低遞減 當(dāng)被分離物之間差異較小時，洗脫液的和pH的變化速度快速率會影響分辨率（如圖5-14）5152（二）收 集 一般按柱體積的12%將洗脫液收集于部分收集器中，分別測定其有效成分的含量，以含量為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的洗脫體積為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線53第五節(jié) 應(yīng) 用54一、制