《增殖資源學》增殖資源學實驗指導

1、增殖資源學實驗指導教學目標與基本要求 通過實驗掌握增殖水域葉綠素a測定方法、認識常見增殖動物各階段幼體形態(tài)，學習魚類的臨界游泳速度的測定方法，掌握魚類等增殖對象標志方法，認識魚類等增殖動物對陰影與巖礁的行為反應，以及增殖對象種群增殖規(guī)律。 實驗內容與安排實驗一 增殖水域葉綠素a測定 實驗二 增殖動物早期發(fā)育與幼體階段 形態(tài)觀察 實驗三 魚類的臨界游泳速度的測定實驗四 增殖動物標志方法實踐實驗五 魚類對陰影與黑板的反應行為 的觀察 實驗一 增殖水域葉綠素a測定實驗目的：通過本實驗讓學生掌握增殖水域中葉綠素a常用測定方法分光光度法 。實驗原理：以有機溶劑直接提取浮游生物濃縮樣中的葉綠素，測定其吸光

2、度，根據(jù)葉綠素a在特定波長的吸收，用公式計算其含量。 實驗儀器與試劑過濾裝置：過濾器、微孔濾膜（50mm，孔徑0.45m）、真空泵 臺式醫(yī)用離心機（最大轉速4000r/min） 研缽 分光光度計（UNIC 7200）及比色皿 碳酸鎂粉末 95乙醇溶液測樣的制備（一）濃縮：用50mm的微孔濾膜過濾濃縮混勻的適量水樣，過濾前加入0.2ml 1（g/ml ）碳酸鎂懸浮液，水樣抽完后，繼續(xù)抽12min，以減少濾膜上的水分 提?。簩⑤d有濃縮樣的濾膜放入有螺帽的離心管中，加入5ml 95%乙醇溶液，再加少許碳酸鎂粉末入離心管中，使總體積不超過10ml，蓋上管塞，充分振搖后置于常溫下暗處820h備用 。測樣

3、的制備（二）離心：將離心管放入離心機中，以4000r/min的速度離心10min后，把上清液移入10ml比色管中，加入少量95乙醇溶液于原提取的離心管中，再次懸浮沉淀物并離心合并上清液，此操作重復23次，直至沉淀物不含色素為止，最后將上清液定容至10ml。 葉綠素a的測定取上清液于1cm或5cm的比色皿中，以95乙醇溶液作參比，讀取波長750、663、645和630nm處的吸光度，選擇比色皿的光程長度或稀釋度，使OD663大于0.2，小于1.0。 葉綠素a的計算根據(jù)葉綠素a在特定波長的吸收，用以下公式計算葉綠素a的濃度。式中：為葉綠素a的濃度（mg/L）；V1為提取液的定容體積（ml）；V2為

4、過濾水樣的體積（L）；L為比色皿光程長度（cm）；D為從各波長的吸光度減去750nm處吸光度的校正過的提取液吸光度 實驗二 增殖動物早期發(fā)育與 幼體階段形態(tài)觀察 實驗目的：通過本實驗觀察讓學生了解常見增殖動物的早期發(fā)育過程，以及它們各階段幼體的形態(tài)特征，從而掌握常見增殖動物的變態(tài)發(fā)育過程。 實驗材料：中國對蝦、三疣梭子蟹、海蜇、刺參等受精卵、胚細胞、各階段幼體的福爾馬林固定標本。實驗儀器：顯微鏡、解剖鏡、解剖針、吸管等 實驗內容觀察刺參的胚細胞與各階段幼體的形態(tài)特征；觀察對蝦的胚細胞與各階段幼體的形態(tài)特征；觀察三疣梭子蟹的胚細胞與各階段幼體的形態(tài)特征； 觀察海蜇的胚細胞與各階段幼體的形態(tài)特征

5、刺參胚胎與幼體發(fā)育圖1. 2細胞；2. 4細胞；3. 8細胞；4. 16細胞；5.原腸胚；6.初耳幼體刺參胚胎與幼體發(fā)育圖7.初耳幼體側面觀；8.樽形幼體；9.五觸手幼體；10.大耳幼體；11.稚參實驗三 魚類的臨界游泳速度的測定 實驗目的：通過本實驗讓學生了解測定魚類游泳速度的常用方法，掌握測定魚類臨界游泳速度的Brett法，以了解魚類的趨流性。 實驗原理利用魚的趨流性，將實驗魚放入水槽或水道中，利用流動的水流迫使魚在不同的流速下進行游動。以指定的增量按預定的時段對水槽中水流的提速。當實驗魚在新流速下持續(xù)穩(wěn)定游完預定的時間后，再以指定的速度增量提高水流速度，進行下一個時間段的游泳實驗。經(jīng)過幾

6、次加速以后，實驗魚疲勞至不能繼續(xù)穩(wěn)定游動，最后被沖到水槽觀察室后端的網(wǎng)柵上。實驗原理（續(xù)）巡航速度根據(jù)Brett公式計算如下： Ucrit=Ui+Uii(Ti/Tii) 式中，Ui為魚類能夠游完整個預定時段的最高速度，單位為cm/s；Uii為指定的速度增量，單位為cm/s；Ti為魚在最后疲勞速度上游動的時間，單位為min；Tii預先指定的時間長度，單位為min。巡航速度可以表示為以cm/s為單位的絕對值，也可以表示成為以BL/S為單位的相對值。 實驗裝置與儀器 垂直循環(huán)回流水槽，流速儀，電子稱，直尺 實驗操作步驟 取實驗魚放置到垂直循環(huán)水槽觀察槽中，以較低的水流速度（0.51BL/S）讓魚適應

7、水槽環(huán)境30-60min。 按照指定的Uii、Tii開始實驗測定，使魚在此水流速度下穩(wěn)定頂流游動30分鐘；繼續(xù)提高水流速度，然后再次計時，直到魚疲勞不能游動，被沖到水槽觀察室后部的網(wǎng)柵上。 記錄此時的Ui和Ti，根據(jù)Brett公式計算得出最大巡航游泳速度值。實驗四 增殖動物的標志方法 實驗目的：了解常見的增殖動物的標志方法，掌握手動注射人工硅膠螢光標記方法。 實驗原理：有形注射人工硅膠標簽是一種注射植入生物透明或半透明組織內部但是從體外依然清晰可見的標簽。在使用這種人工硅膠標簽時，先將兩種有機硅材料混合成一種混合液體，然后將這種液體立即注入被標記生物的組織內，液體就會很快凝固形成一種柔軟的固體

8、物質，起到標記該生物的作用。 實驗材料、試劑與器材實驗材料：中國對蝦幼蝦（4-6cm） 試劑：6種螢光色（紅、橙、綠、黃、粉、藍），4種非螢光色（棕色、黑色、紫色、白色），固化劑（硅膠） 器材：注射器（1ml ，0.3ml），混合杯，人工硅膠手動注射管，可變間隔光源燈，標準比色卡。 標志原料混合方法 （一）為了使原料混合后能達到理想的效果，我們在操作時必須要把兩種原料（有色原料和固化劑）按照10：1的比例均勻混合。 第一步：把裝有有色原料的注射器的黑帽拔下，按照注射器上的刻度，按所需量將原料從注射器中注入混合杯中，然后把黑帽重新安放在注射器上。 標志原料混合方法 （二）第二步：把裝有固化劑的注

9、射器的黑帽拔下，按照注射器上的刻度，釋放出相當于有色原料1/10量的固化劑于混合杯中，使其與有色原料混合。第三步：徹底攪拌使有色原料和固化劑混合均勻。攪拌并且刮擦杯壁和杯底一分鐘整，但也不要攪拌過長，以確保各種物質能完全混合?；旌暇鶆蛞院?，混合物在一小時之內（視溫度而定）可以被使用注射器注射進入生物體內來做標記。 標志原料混合方法 （三）第四步：把一個0.3毫升的注射器針帽摘掉，拔下活塞。使用一個新的1毫升的注射器慢慢的從混合杯中吸取少量原料混合液，接著拔掉這個注射器的針頭。1毫升注射器的針管前端恰好能緊緊的插入0.3毫升注射器針管的尾部。用1毫升注射器向0.3毫升的注射器中注入1/3左右的混

10、合液。把這些裝載了混合液的0.3毫升注射器放在冰塊中或冰箱里，以延長注射器中混合液的可以等待被注射進生物體的時間。 標志原料混合方法 （四）第五步：把注射器的活塞重新安裝在0.3毫升的注射器上，拔下覆蓋在針頭上的橙紅色針帽。推動活塞，直到針尖上出現(xiàn)一小滴混合液。然后把這些注射器安裝到人工硅膠手動注射管內，接著把人工硅膠手動注射管放在合適的位置就行了。手動注射人工硅膠熒光標記 使用者可以將針頭斜刺插入到所希望注射標記的位置，然后一邊把針頭向外慢慢的抽出一邊將人工硅膠注入組織內。在注射時，使用者應隨手攜帶一塊海綿或紙巾以方便在每次注射完后擦掉針頭上多余的人工硅膠。 在標記注射過程中應該注意在將針頭

11、完全抽出組織之前就要停止注入人工硅膠，以避免人工硅膠從針頭刺入的傷口中流出堵塞傷口，使傷口無法愈合從而增加了被標記生物的死亡概率，導致標記實驗結果不準確。任何一點從傷口流出的人工硅膠都應該被輕輕的沿著標記的方向擦去。 標記的檢測方法 雖然有形注射人工硅膠標記通常能在陽光或室內光線下被肉眼觀察到，但是通過可變間隔光學技術（VI Light），標記的可視性會更大的提高。這種技術可以在不需要濾光器的條件下使綠、黃、橙、紅、粉、藍色標記閃現(xiàn)更明顯的熒光。在這種情況下，一個很小的標記可以在相當大的距離上被看到。在自然光線下模糊的標記也會變得十分醒目。 使標記的檢測達到最佳效果的措施選擇明顯的顏色作為標記

12、色盡可能選擇容易觀察的組織進行標記適當馴化你所標記的動物，讓它們習慣帶著標記生活使用標準比色卡正確的辨別顏色對于比較模糊的標記，應該在可變間隔光學技術下進行熒光觀察 可變間隔光學技術的使用 打開可變間隔光源燈，調整它使其不再閃爍。在使用時，將光線直接對準標記所在處或是你認為的標記所在處。如果在陽光下操作，應該找個陰涼處觀察，或用身體遮擋出的陰影也足夠了，對于比較模糊的標記最好在黑暗處進行熒光觀察。 實驗五 魚類趨礁行為反應的觀察 實驗目的：通過本實驗觀察魚類對礁體的行為反應，測定實驗對象對礁體的反應率，以推斷實驗對象產(chǎn)生聚礁行為的可能性大小。 實驗原理：魚類是憑借視覺、聽覺、嗅覺以及對流態(tài)變化的感覺來感知魚礁或其他物體的存在；另一方面，魚礁也給予魚類以不同的刺激，諸如視覺、音波、接觸和流的刺激等。本實驗通過對象魚對礁體反應行為，模擬魚對魚礁的視覺刺激反應。 實驗材料、設施與設備實驗材料：條石鯛（體長35cm左右），三角形和正方形魚礁模型。 實驗設施與設備：圓形水槽（3m3），數(shù)碼相機，攝像機。 陰影實驗操作步驟 實驗用魚需經(jīng)1周的室內暫養(yǎng)適應將經(jīng)過室內適應性暫養(yǎng)的魚放入實驗水槽中，待魚穩(wěn)定后，觀測魚群散布特征，并拍照；放置1三角形魚礁模型，然后觀察記錄魚群分布特征，以及在礁內和周邊滯留的尾次與時間長短，同時進行拍照與錄像用以試驗結束后的行為分析