基因工程第三章操作技術

1、基因工程第三章操作技術第1頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二六. Different ramificate(衍生的）methods of PCR1、熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。 原因：盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，PCR反應體系配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。 對策： 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，

2、因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。第2頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。 包括延緩加入Taq DNA聚合酶; 使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起; 聚合酶的活性需經(jīng)過 95 10mins 的高溫造成化學修飾基團的脫落，然后才有聚合的活性. 第3頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二2、Touch-down PCRTouch-down PCR又稱降落PCR。即選定一個溫度

3、范圍，如6550 ，每降1-2 進行1-2個循環(huán)，然后在50度下進行15個循環(huán)。 Touch-down的原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴增出來，其濃度遠遠超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴增。 選擇初始復性溫度的原則：起始復性溫度應該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減1-2度第4頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二Touch-down PCR的應用范圍low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the s

4、et of primers; RT-PCR using oligo-dT.第5頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二3、巢氏PCR（Nested PCR）巢氏PCR需要兩到三對引物，一般采用第一套引物擴增15-30個循環(huán)，再用擴增DNA片段內(nèi)設定的第二套引物擴增15-30個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級序列卻很少擴增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。 若將巢氏PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（25-30bp），同時縮短內(nèi)引物長度（15-17bp），使外引物先在高退火溫度下復性，做雙溫擴增，使內(nèi)引物在外引物擴增的

5、基礎上，在低退火溫度復性，直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入。第6頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二4、原位PCR原位PCR就是在組織細胞里進行PCR反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術的優(yōu)點，是細胞學科研與臨床診斷領域里的一項有較大潛力的新技術.原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等.其基本方法為固定細胞:將組織細胞固定于預先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，滅活除去細胞內(nèi)源性過氧化物酶.蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55消化

6、處理2h后，962min以滅活蛋白酶K.PCR擴增:在組織細胞片上，加PCR反應液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬板上，進行PCR循環(huán)擴增.有的基因擴增儀帶有專門用于原位PCR的裝置.雜交:PCR擴增結束后，用標記的寡核苷酸探針進行原位雜交.顯微鏡觀察結果.原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置，于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉歸有重大的實用價值.其特異性和敏感性高于一般的PCR.第7頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第8頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二6、免疫-PCR(immuno-

7、PCR)免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測.免疫-PCR試驗的主要步驟有三個:抗原-抗體反應，與嵌合連接分子結合，PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技術的關鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質(zhì)粒DNA結合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標記物不是酶而是質(zhì)粒DNA，在操作反應中形成抗原抗體-連接分子-DNA復合物，通

8、過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原.免疫PCR優(yōu)點為:特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性反應的基礎上.敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢測.操作簡便，PCR擴增質(zhì)粒DNA比擴增靶基因容易得多，一般實驗室均能進行 第9頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二自從1988年，Chamberlain研究表明PCR可以同時擴增人類肌營養(yǎng)不良蛋白基因多個基因座以來，多重PCR技術得到研究人員的廣泛關注，并且已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一種通用技術。如今，多重PCR技術已經(jīng)廣泛的應用于病原體鑒定、性別篩選、連鎖分析、法醫(yī)研究、

9、模板定量和遺傳疾病診斷之中。 7、多重PCR第10頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二多重PCR（multiplex polymerase chain reaction， MPCR）也稱為復合PCR，是在常規(guī)PCR的基礎之上進行改進從而發(fā)展起來的一種新型的PCR擴增技術，多重PCR技術的基本原理與常規(guī)的PCR技術相同。多重PCR技術主要有兩種形式：一、將多條引物和多個模板DNA混合在同一個反應體系中分別特異擴增不同的目的條帶，常用于突變?nèi)笔z測、多態(tài)分析等；二、將多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應體系中擴增同一模板的不同片段，常用于對超長片段的擴增。第11頁，共23頁

10、，2022年，5月20日，12點6分，星期二多重PCR的優(yōu)點：高效性，在同一PCR反應管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進行分型，且所需模板或樣品量極少，應用一滴血就可檢測多種病原體。系統(tǒng)性，多重PCR很適宜對癥狀相同或容易污染相同食品的一組病原菌進行分析，即適宜對成組病原體進行檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細菌及細菌戰(zhàn)劑的同時檢測經(jīng)濟簡便性，多種病原體在同一反應管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床或食品安全檢測提供更多更準確的診斷信息。多重PCR的不足：靈敏性和檢測的特異性低 需要優(yōu)先擴增某一特定片段 容易形成引物二

11、聚體。多重PCR要求不同的引物能在同一反應體系中進行各自的特異性擴增，但是它的體系建立和條件優(yōu)化過程需要較長的時間，所以在一定程度上限制了該方法的推廣應用。第12頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二面臨的問題： 在多重PCR的反應體系中，由于涉及到的引物比較多，因此比較容易造成引物二聚體、錯配和非特異性擴增等現(xiàn)象，從而降低擴增反應的效率。所以在建立一個多重PCR反應體系的時候，需要對設計的引物，反應體系的組成和PCR循環(huán)條件等進行反復的摸索，并進行優(yōu)化。第13頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二8.反向PCR：常規(guī)PCR只能擴增兩個引物之間的DNA區(qū)段，

12、但有時我們想知道基因之外的兩側未知DNA序列，這樣就出現(xiàn)了反向PCR。反向PCR首先將DNA用限制性內(nèi)切酶切割，切割要保持已知序列兩端有未知序列，進行環(huán)化，然后用引物進行擴增。產(chǎn)物是已知序列以外的序列。第14頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二9.PCRRFLP(restriction fragment length polymorphism) 是一種借助于限制性內(nèi)切酶對PCR擴增片斷進行酶切分析的方法。用于鑒定分類。基因有保守區(qū)，有可變區(qū)，我們可以依據(jù)保守區(qū)設計共同的引物，然后用酶進行酶切分析，不同的物種的酶切分析圖不同，這種圖譜也叫指紋圖譜?？勺兛勺儽Ｊ氐?5頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二10. PCR定點誘變：法的原理也是利用人工合成帶突變位點的誘變引物，通過擴增而獲得定點突變的基因或片段。PCR定點誘變法可分為重組PCR定點誘變法和大引物誘變法兩種。 第16頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第17頁，共23頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第18頁，共23頁，2022