基因工程第三章操作技術(shù)

1、基因工程第三章操作技術(shù)第1頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二六. Different ramificate(衍生的）methods of PCR1、熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。 原因：盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，PCR反應(yīng)體系配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。 對(duì)策： 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，

2、因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。第2頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。 包括延緩加入Taq DNA聚合酶; 使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起; 聚合酶的活性需經(jīng)過(guò) 95 10mins 的高溫造成化學(xué)修飾基團(tuán)的脫落，然后才有聚合的活性. 第3頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二2、Touch-down PCRTouch-down PCR又稱降落PCR。即選定一個(gè)溫度

3、范圍，如6550 ，每降1-2 進(jìn)行1-2個(gè)循環(huán)，然后在50度下進(jìn)行15個(gè)循環(huán)。 Touch-down的原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時(shí)已經(jīng)擴(kuò)增出來(lái)，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。 選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個(gè)循環(huán)遞減1-2度第4頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二Touch-down PCR的應(yīng)用范圍low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the s

4、et of primers; RT-PCR using oligo-dT.第5頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二3、巢氏PCR（Nested PCR）巢氏PCR需要兩到三對(duì)引物，一般采用第一套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級(jí)序列卻很少擴(kuò)增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。 若將巢氏PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長(zhǎng)外引物長(zhǎng)度（25-30bp），同時(shí)縮短內(nèi)引物長(zhǎng)度（15-17bp），使外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫?cái)U(kuò)增，使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的

5、基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)加入。第6頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二4、原位PCR原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù).原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等.其基本方法為固定細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶.蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55消化

6、處理2h后，962min以滅活蛋白酶K.PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置.雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交.顯微鏡觀察結(jié)果.原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值.其特異性和敏感性高于一般的PCR.第7頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二第8頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二6、免疫-PCR(immuno-

7、PCR)免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測(cè)系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性來(lái)檢測(cè)抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測(cè).免疫-PCR試驗(yàn)的主要步驟有三個(gè):抗原-抗體反應(yīng)，與嵌合連接分子結(jié)合，PCR擴(kuò)增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個(gè)與質(zhì)粒DNA結(jié)合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標(biāo)記物不是酶而是質(zhì)粒DNA，在操作反應(yīng)中形成抗原抗體-連接分子-DNA復(fù)合物，通

8、過(guò)PCR擴(kuò)增DNA來(lái)判斷是否存在特異性抗原.免疫PCR優(yōu)點(diǎn)為:特異性較強(qiáng)，因?yàn)樗⒃诳乖贵w特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上.敏感度高，PCR具有驚人的擴(kuò)增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個(gè)抗原的檢測(cè).操作簡(jiǎn)便，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒DNA比擴(kuò)增靶基因容易得多，一般實(shí)驗(yàn)室均能進(jìn)行 第9頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二自從1988年，Chamberlain研究表明PCR可以同時(shí)擴(kuò)增人類肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因多個(gè)基因座以來(lái)，多重PCR技術(shù)得到研究人員的廣泛關(guān)注，并且已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一種通用技術(shù)。如今，多重PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于病原體鑒定、性別篩選、連鎖分析、法醫(yī)研究、

9、模板定量和遺傳疾病診斷之中。 7、多重PCR第10頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二多重PCR（multiplex polymerase chain reaction， MPCR）也稱為復(fù)合PCR，是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)之上進(jìn)行改進(jìn)從而發(fā)展起來(lái)的一種新型的PCR擴(kuò)增技術(shù)，多重PCR技術(shù)的基本原理與常規(guī)的PCR技術(shù)相同。多重PCR技術(shù)主要有兩種形式：一、將多條引物和多個(gè)模板DNA混合在同一個(gè)反應(yīng)體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶，常用于突變?nèi)笔z測(cè)、多態(tài)分析等；二、將多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板的不同片段，常用于對(duì)超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增。第11頁(yè)，共23頁(yè)

10、，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二多重PCR的優(yōu)點(diǎn)：高效性，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，且所需模板或樣品量極少，應(yīng)用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。系統(tǒng)性，多重PCR很適宜對(duì)癥狀相同或容易污染相同食品的一組病原菌進(jìn)行分析，即適宜對(duì)成組病原體進(jìn)行檢測(cè)，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無(wú)芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時(shí)檢測(cè)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床或食品安全檢測(cè)提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。多重PCR的不足：靈敏性和檢測(cè)的特異性低 需要優(yōu)先擴(kuò)增某一特定片段 容易形成引物二

11、聚體。多重PCR要求不同的引物能在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行各自的特異性擴(kuò)增，但是它的體系建立和條件優(yōu)化過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以在一定程度上限制了該方法的推廣應(yīng)用。第12頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二面臨的問(wèn)題： 在多重PCR的反應(yīng)體系中，由于涉及到的引物比較多，因此比較容易造成引物二聚體、錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象，從而降低擴(kuò)增反應(yīng)的效率。所以在建立一個(gè)多重PCR反應(yīng)體系的時(shí)候，需要對(duì)設(shè)計(jì)的引物，反應(yīng)體系的組成和PCR循環(huán)條件等進(jìn)行反復(fù)的摸索，并進(jìn)行優(yōu)化。第13頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二8.反向PCR：常規(guī)PCR只能擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA區(qū)段，

12、但有時(shí)我們想知道基因之外的兩側(cè)未知DNA序列，這樣就出現(xiàn)了反向PCR。反向PCR首先將DNA用限制性內(nèi)切酶切割，切割要保持已知序列兩端有未知序列，進(jìn)行環(huán)化，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增。產(chǎn)物是已知序列以外的序列。第14頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二9.PCRRFLP(restriction fragment length polymorphism) 是一種借助于限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增片斷進(jìn)行酶切分析的方法。用于鑒定分類?；蛴斜Ｊ貐^(qū)，有可變區(qū)，我們可以依據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)共同的引物，然后用酶進(jìn)行酶切分析，不同的物種的酶切分析圖不同，這種圖譜也叫指紋圖譜?？勺兛勺儽Ｊ氐?5頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二10. PCR定點(diǎn)誘變：法的原理也是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的誘變引物，通過(guò)擴(kuò)增而獲得定點(diǎn)突變的基因或片段。PCR定點(diǎn)誘變法可分為重組PCR定點(diǎn)誘變法和大引物誘變法兩種。 第16頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二第17頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)6分，星期二第18頁(yè)，共23頁(yè)，2022