WATERS公司的UPLC-TQD培訓資料MS1LCMS基礎

1、WATERS公司的UPLC-TQD培訓資料MS1LCMS基礎WATERS公司的UPLC-TQD培訓資料MS1LCMS基礎什么是質譜(Mass Spectrum)不同質荷比的離子經(jīng)質量分析器分離,而后被檢測并記錄下來的譜圖叫作質譜圖.簡稱質譜質譜圖的橫坐標是質荷比(m/z)，縱坐標是離子強度質譜法(Mass Spectrometry)即質譜分析法,一般亦簡稱為質譜什么是質譜(Mass Spectrum)不同質荷比的離子經(jīng)質氯霉素的質譜圖氯霉素的質譜圖MS 檢測的是離子質量MS 檢測的是離子質量質譜基礎知識 質譜中采用的質量單位Da=Dalton (道爾頓 ) 質量單位,等于一個碳原子(12C)質

2、量的十二分之一，約為1.6610 -24克;一克約為610 23道爾頓amu=atomic mass unit ,原子質量單位 1amu=1Da質譜基礎知識 質譜中采用的質量單位質譜基礎知識 同位素: 具有相同的原子序數(shù)而又具有不同的質量數(shù) 的原子叫作同位素同位素豐度: 自然界中某同位素原子所占的百分數(shù)叫做該同 位素的天然豐度 質譜基礎知識 同位素:同位素表示法C126C136質量數(shù) = 質子 + 中子原子序數(shù) = 質子數(shù)具有相同的元素符號,在元素符號的左上角表明其質量數(shù)同位素表示法C126C136質量數(shù) = 質子 + 中子原子序天然同位素豐度 氮 14N 14.0031 99.64 15N

3、15.0001 0.36硫32S31.972195.033S32.97150.7634S33.96794.22氯35Cl34.968975.7737Cl36.9659 24.23溴79Br78.918350.6981Br80.916349.31 原子符號質量, amu% 天然豐度天然同位素豐度 氮 14N 怎樣計算質量數(shù)名義質量數(shù)采用元素質量數(shù)的整數(shù)進行計算,例如:C=12,H=1,O=16單同位素質量數(shù)或準確質量數(shù)用豐度最大的同位素準確質量數(shù)計算例如：C=12，1H=1.0078，16O=15.9948 平均質量數(shù)或化學質量數(shù)考慮到所有天然同位素豐度的該元素原子量來計算例如：C=12.001

4、，H=1.00794，O=15.9994質譜獲得的單電荷離子的m/z值，是單同位素質量數(shù)怎樣計算質量數(shù)名義質量數(shù)MS分子量的計算利血平, C33H40N2O9,的MW的計算 使用原子量: 使用單一同位素質量:C: 33 x 12.011 = 396.363 C: 33 x 12.0000 = 396.000 H: 40 x 1.0079 = 40.316 H: 40 x 1.0078 = 40.312 N: 2 x 14.0067 = 28.013 N: 2 x 14.0031 = 28.006 O: 9 x 15.9994 = 143.995 O: 9 x 15.9949 = 143.954

5、 608.687 608.272MS分子量的計算利血平, C33H40N2O9,的MW的計算質譜名詞與術語質荷比(mass charge ratio): 離子的質量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,叫作質荷比,簡寫為m/z質荷比是質譜圖的橫坐標質荷比是質譜定性分析的基礎質譜名詞與術語質荷比(mass charge ratio):離子豐度 (Abundance of ions): 檢測器檢測到的離子信號強度離子相對豐度 (Relative abundance of ions): 以質譜圖中指定質荷比范圍內(nèi)最強峰(基峰)的強度為100, 其它離子峰對其歸一化所得的強度

6、標準質譜圖均以離子相對豐度值為縱坐標 譜峰的離子豐度與物質的含量相關,因此是質譜定量的基礎質譜名詞與術語 離子豐度 (Abundance of ions): 質譜名詞MS是高真空技術質譜儀之所以在高真空下工作是為了 .盡量減少離子-分子之間的碰撞 (即,得到最大平均自由程)碰撞可能導致離子偏離所期望的由離子源到檢測器的通道碰撞可能導致產(chǎn)生意外的離子或反應平均自由程:1 atm10 -6 m ; 10-4 torr 0.5 m防止在高電壓 (用于某些離子聚焦)下生成電弧減少污染/化學噪音MS是高真空技術質譜儀之所以在高真空下工作是為了 .MS的歷史1910年 世界上第一臺現(xiàn)代意義質譜儀在英國劍橋

7、 Cavendish實驗室出現(xiàn)1917年 電噴霧(Electrospray) 物理現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn) (并非 為了 MS)1918年 世界上第一臺實際意義質譜儀在美國芝加哥 大學實驗室出現(xiàn)(扇型磁場MS)1943年 世界上第一臺商業(yè)質譜儀1953年 四極桿質量分析器質譜儀1955年 飛行時間質量分析器質譜儀1960s 開發(fā)GC/MSMS的歷史1910年 世界上第一臺現(xiàn)代意義質譜儀在英國MS的歷史60s-70s 大氣壓電離(APcI)源被發(fā)現(xiàn)(但并未被廣泛 應用)70s-80s 開始廣泛研究 LC/MS1979年 傳送帶式 LC/MS 接口成為商業(yè)產(chǎn)品1982年 離子束LC/MS接口出現(xiàn)1984年 第一

8、臺電噴霧 MS儀宣告誕生 1988年 電噴霧離子源 MS 首次應用于蛋白質的分析.MS的歷史60s-70s 大氣壓電離(APcI)源被質譜的分類 按離子源的種類分EI (電子轟擊源)質譜(常用于GC-MS系統(tǒng))API (大氣壓電離源)質譜(常用于LC-MS系統(tǒng))MALDI(基質輔助激光解吸電離源)質譜(常用于生物大分子分析)按質量分析器的種類分四極桿(Quadrupole)質譜離子阱(Ion Trap)質譜飛行時間(Time of Flight,TOF)質譜扇形磁場(Magnetic Sector)質譜質譜的分類 按離子源的種類分什么是液質聯(lián)用(LC/MS)LC/MS=LC+MS什么是液質聯(lián)用

9、(LC/MS)LC/MS=LC+MSLC/MS中的液相色譜High Performance Liquid Chromatography(HPLC) -高效液相色譜Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC) -超高效液相色譜液質聯(lián)用的前提和基礎=進樣+分離根據(jù)化合物的化學特性分離樣品(比如極性化合物，非極性化合物，酸性化合物，堿性化合物等等)LC的特點:分離技術分離效率高流動相參與分離連續(xù)流出,峰寬有限有時需要使用緩沖鹽提高分離度高壓環(huán)境工作( 1000 psi)LC/MS中的液相色譜High Performance Li LC/MS中的質譜Mas

10、s Spectrometry-質譜質量是物質固有特征之一，不同的物質有不同的質量譜分析物被轉化為氣相離子而被分析這些離子按其質荷比 (m/z)被分離而被檢測質譜圖即是相關的離子流對m/z的圖MS的特點靈敏度高定性/定量本領高脈沖掃描采集數(shù)據(jù)高真空環(huán)境工作溶劑參與反應(API電離源) LC/MS中的質譜Mass Spectrometry-質LC/MS 數(shù)據(jù)形式 TIC色譜 m/z1001502002503003509110712314517519132379201341402384366M -18M+M -36M -79M -162241保留時間TICLC/MS 數(shù)據(jù)形式 TIC色譜 m/z10

11、01502002為什么使用 LC/MS? 豐富的結構信息(1)Min12141618202224262830 124357500600700800695100200300400500600700800219.0696.7EI HOCH CH O222COCH CH 22NHCONaugardAPI為什么使用 LC/MS? 豐富的結構信息(1)Min121為什么使用 LC/MS? 極高的靈敏度 (2)為什么使用 LC/MS? 極高的靈敏度 (2)5 個數(shù)量級的動態(tài)線性范圍 (0.1pg - 1000pg)實驗系數(shù)= 0.9975,樣品:磺胺二甲氧噠嗪上柱分析為什么使用 LC/MS? 極佳的定量結

12、果(3)5 個數(shù)量級的動態(tài)線性范圍 (0.1pg - 1000pg)為什么使用 LC/MS? 進一步增加HPLC的分離能力(4)如果讓您來選擇，您滿意那一種分離度?為什么使用 LC/MS? 進一步增加HPLC的分離能力(為什么使用 LC/MS? 解決無UV吸收樣品分析問題(5)LC_MS_OK5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00Time0100%0100%TaiyuanLC_MS52: Diode Array 254 1.00Da1.71e6x36TaiyuanLC_MS51: Scan AP+ BPI8.29e45.844.812.912.272.0

13、44.007.229.1211.599.9814.8713.1519.1217.4025.1621.4222.5233.7833.3228.8426.8235.0438.2639.52為什么使用 LC/MS? 解決無UV吸收樣品分析問題(5)兩種 LC/MS 系統(tǒng)示意圖液質聯(lián)用接口 至真空離子源質量分析器 檢測器離子源液質聯(lián)用接口至真空質量分析器檢測器高真空部分高真空部分樣品引入樣品引入EI電離源API電離源兩種 LC/MS 系統(tǒng)示意圖液質聯(lián)用接口 至真空離子源質量分 LC/MS聯(lián)用的難點 進樣方式比較 對真空泵的要求 * (liters/sec) 毛細管 GC, 1mL/min (氣體) 4

14、00 微柱 LC, 10 L/min 5,000 填充柱 LC, 1 mL/min 50,000 *為了保持 3 x 10-6 torr (4 x 10-6 mbar)的真空LC/MS 接口必須使LC流出的液流達到 MS 可接受的壓力(10-5 - 10-6 torr) 同時以極小的譜帶展寬盡可能多地輸送樣品離子到MS LC/MS聯(lián)用的難點 進樣方式比LC/MS聯(lián)用關鍵技術接口液相色譜的出口情況: 從液相色譜流出的組分存在于大氣壓條件下的溶液之中 質譜的入口情況: 在高真空工作條件下的質譜僅接受氣相離子 因此液質聯(lián)用的接口必須完成三個轉變:物態(tài)轉變: 液態(tài) - 氣態(tài)帶電狀態(tài): “中性” - 離

15、子真空變化: 760 torr - 10-5-10-8 torr(乇)要求:霧化,去溶劑和電離同時完成LC/MS聯(lián)用關鍵技術接口液相色譜的出口情況: 從液相色譜API LC/MS 的 Z-Spray接口API LC/MS 的 Z-Spray接口Z-Spray 接口技術第 1 次進樣第 509次進樣25小時苯海拉明, 10mM 磷酸鹽緩沖液Z-Spray 接口技術第 1 次進樣苯海拉明, 10mM MS的電離技術質量過濾器樣品引入MS的電離技術質量過濾器樣品引入質譜的種類及相關聯(lián)用技術GCLCCEFlow InjProbePB/EIESIAPCITSPFABMALDIQuadrupoleMagn

16、etic SectorTime of FlightIon TrapFT-MSElectron MultiplierPhotomultiplierMicrochannel PlateTurbo Mechanical離子分離模式質量分析器離子檢測數(shù)據(jù)的采集及處理樣品的引入模式溶劑的去除或抽 真空方式質子化模式質譜的種類及相關聯(lián)用技術GCLCCEFlow InjProb同一個樣品的質譜圖可能不一樣同一個樣品的質譜圖可能不一樣傳統(tǒng)的樣品電離方式：EI源EI源：電子轟擊電離源可得經(jīng)典的質譜譜圖可查詢質譜庫，質譜結果可用工業(yè)標準譜庫檢索，是絕對的化合物鑒定相對易得，耐受性好譜圖可解析,闡明結構信息但是,電

17、離效率較差，測定的分子量范圍、流速范圍有限；可測的化合物類型有限M樣品進入燈絲集電極離子聚焦透鏡離子去分析器-擋板+傳統(tǒng)的樣品電離方式：EI源EI源：電子轟擊電離源M樣品進入燈EI 譜庫:幾十年積累的寶貴財富High Res Mass Spec, Brown, Kamano, Pettit, Org. Mass Spec., 1972Waters Integrity LC/MS System, Pfizer, 2019EI 譜庫:幾十年積累的寶貴財富High Res Mass 大氣壓電離 (API) 技術電噴霧電離Electrospray Ionization ESI大氣壓化學電離Atmosp

18、heric Pressure Chemical Ionization - APCI大氣壓電離 (API) 技術電噴霧電離電噴霧(ESI) 離子化過程電噴霧離子化可分為三個過程:形成帶電小液滴溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂最終形成氣相離子電噴霧(ESI) 離子化過程電噴霧離子化可分為三個過程: ESI的特點低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(失去或得到一個質子) 高分子量生物大分子和聚合物產(chǎn)生多電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和/或多聚體常見的是溶劑加合物和NH4+(M+18), Na+(M+23),和K+(M+39) 加合物靈敏度取決于化合物本身和基質 ESI的特點低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(

19、失去或得到一ESI+ 電離模式滅多蟲MW 162產(chǎn)生 M+H+ 準分子離子峰ESI+ 電離模式滅多蟲產(chǎn)生 M+H+ 準分子離子峰大氣壓化學電離 (APCI)過程大氣壓化學電離可分為以下兩個步驟:快速蒸發(fā)氣相化學電離(電暈放電)大氣壓化學電離 (APCI)過程大氣壓化學電離可分為以下兩個APCI的特點一般而言, 只生成單電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和/或多聚體; 一般是溶劑加合物及NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 基質影響較小 (相對于ESI), 質譜圖不受緩沖鹽及其緩沖力變化的影響APCI的特點一般而言, 只生成單電荷離子API與傳統(tǒng)電離技

20、術的區(qū)別液質聯(lián)用接口 至真空離子源質量分析器 檢測器離子源液質聯(lián)用接口至真空質量分析器檢測器高真空部分高真空部分樣品引入樣品引入EI電離源API電離源API與傳統(tǒng)電離技術的區(qū)別液質聯(lián)用接口 至真空離子源質量分析不同電離技術的適用范圍 分子量化合物極性API(APcI-ESI)ParticleBeam(EI-CI)GC/MS(EI-CI)非極性極性(離子)102103104105APPI不同電離技術的適用范圍 分子量化合物極性APIP液質聯(lián)用系統(tǒng)的質量分析器質量過濾器樣品引入液質聯(lián)用系統(tǒng)的質量分析器質量過濾器樣品引入A. 磁質譜通過磁場和電場來傳輸和選擇離子+離子源電場磁場A. 磁質譜通過磁場和電場來傳輸和選擇離子+離子源電場磁B. 飛行時間質譜所有離子一同起跑質量小的跑得快時間分辨 +離子源B. 飛行時間質譜所有離子一同起跑+離子源SourceDetectorNonresonant IonResonant Iondc and Rf voltagesC. 四極桿質量分析器被分析離子由DC和RF電壓控制SourceDetectorNonresonant IonRD. 離子阱原理與四極桿類似 離子被 RF & DC 電場所儲存掃描電場可以釋放特定的m/z離子D. 離子阱原理與四極桿類似 分析器 m/z范圍 分辨率 質量精度 動態(tài)范圍 真空 四極桿 103