流式細胞術(shù)講義

1、流式細胞術(shù)講義第1頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四流式細胞術(shù)的概念 流式細胞術(shù)（Flow cytometry；FCM）是集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)等多門高新技術(shù)與方法為一體的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)，它以流式細胞儀（Flow cytometer）為工具，在單細胞水平上對大量細胞進行高速（每秒計數(shù)可達100010000個細胞）、準確、多參數(shù)的定量分析或分選（純度可達99%以上），已成為現(xiàn)代骨髓血細胞學(xué)研究中最先進的分析技術(shù)。第2頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四流式細胞術(shù)與PNH的診斷第3頁，共24頁，2022年，5

2、月20日，11點21分，星期四原 理 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）是一種獲得性基因突變所致的克隆性疾病，其異常的血細胞膜糖化肌醇磷脂錨（GPIanchor）連接蛋白如CD59,CD55等表達明顯減低或缺乏，導(dǎo)致對補體的敏感性增強而產(chǎn)生溶血性貧血。第4頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四樣本要求：EDTA抗凝血或骨髓3ml每天上午送檢收費：CD55/CD59 280元 CD59 140元第5頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四臨 床 診 斷 值CD59陽性的紅細胞大于等于95%CD59陽性的中性粒細胞大于90%第6頁，共24頁，2022年，5月2

3、0日，11點21分，星期四流式細胞術(shù)與白血病免疫分型第7頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四免疫分型原理 流式細胞術(shù)（FCM）白血病免疫分型是利用熒光染料標記的單克隆抗體（McAb）檢測相應(yīng)抗原，經(jīng)過多參數(shù)分析，測定白血病細胞的細胞膜、細胞漿和細胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型時測量細胞數(shù)量一般是在1000050000個細胞之間，而且快速、特異、準確、重復(fù)性好，能區(qū)分細胞的系列，劃分其分化、發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機制研究等有重要價值。第8頁，共24頁，2022年，5月20日，1

4、1點21分，星期四樣本要求：肝素抗凝骨髓3ml(或外周血)每天上午送檢收費： 70元/每個單抗(臨床常規(guī)檢測12個單抗)第9頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四干/祖細胞標志： CD34、CA133髓系標志： CD33、CD13、CD11b、CD15、MPOB細胞相關(guān)標志： CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIgT細胞相關(guān)標志： CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8第10頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四常用白血病免疫分型熒光素標記單克隆抗體組合及其意義管號三色標記McAb染色細胞及目的1Mou

5、seIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP陰性對照及設(shè)門2CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCPT淋巴系細胞、部分早期髓系細胞3CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCPB淋巴系細胞4Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP髓系細胞、 B淋巴系細胞、部分T淋巴系細胞5CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP反映細胞分化程度6CD14 FITC/CD33 PE/ CD45 PerCP髓系細胞和單核細胞7CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCPB淋巴系細胞及其分化程度8CD8 FI

6、TC/CD4 PE/ CD45 PerCPT淋巴系細胞及其分化程度9CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCPT淋巴系細胞、NK細胞10CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP幼紅細胞11CD61 FITC/CD41 PE/ CD45 PerCP巨核細胞第11頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四B-ALLT-ALLAMLCD10+CD19+CD22c/m+CD3c/m+CD5+CD7+CD13+CD33+MPO+第12頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四AML 免疫分型FAB/CD34CD33HLA-DR CD1

7、3CD14CD15CD11b其它M1M2M3CD38CD9M4M5M6CD71GP-AM7CD41CD61第13頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四T-ALL免疫分型CD2CD3CD5CD7CD4CD8TdT早期T-ALL+前TALL+T-ALL+第14頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四B-ALL免疫分型HLA-DRCD19CD10CD20CD22cIgMmIgMTdT早B前體ALL+普通型+前B-ALL+B-ALL+第15頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四FCM-IM診斷混合型白血病流式細胞術(shù)測定發(fā)現(xiàn)的雙系列或多系列表達的

8、結(jié)果較多，但雙表型白血病不一定就是混合型，理由如下：混合型白血病診斷：應(yīng)根據(jù)形態(tài)、免疫、遺傳、分子生物學(xué)等綜合判斷，屬雙系列（雙克?。侩p表型（單克?。?？系列轉(zhuǎn)換型？需考慮到抗原/單抗的多向性：CD4、CD7、CD10、CD38、CD56正常血細胞隨分化成熟，各系列血細胞的免疫標志特性逐步規(guī)律化：白血病細胞的分化發(fā)育卻喪失嚴格的規(guī)律性（lineage infidelity）與免疫表型的階段性（differentiation asynchrony），因而出現(xiàn)異?？乖磉_，或過高或過低或不表達或交叉系列表達。第16頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四設(shè)門方案采用CD45/SS

9、C設(shè)門法（優(yōu)于FSC/SSC設(shè)門法）CD45其表達程度在不同細胞各異。淋巴細胞單核細胞成熟粒細胞原/幼細胞，而紅細胞不表達。SSC在成熟粒細胞單核細胞原/幼細胞淋巴細胞紅細胞。第17頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四臨床原/幼細胞群定量按照新的WHO分型標準，對初發(fā)病者，原/幼細胞占總細胞數(shù)20%以上即可判為白血病。對于臨床原/幼細胞群定量應(yīng)以原/幼細胞群的細胞數(shù)為分母。對于臨床原/幼細胞群定性比定量更重要。第18頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四白血病免疫分型病例分析病例1梁麗琴 女性 24歲異常表型中:CD10+. CD34+.CD22+.

10、CD38+.CD19+. HLA-DR+結(jié)論：表型符合Pre-B-ALL第19頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四白血病免疫分型病例分析病例2王丙午 男性 68歲異常表型中:CD33+. CD13+.CD15+.CD11b+. HLA-DR+.CD34+.CD19+結(jié)論：表型符合AML-M2第20頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四白血病免疫分型病例分析病例3馮亮 男性 33歲異常表型中:CD34+. CD10+. CD22+. CD19+. CD33+. CD13+.CD15+. HLA-DR+結(jié)論：表型符合雙表型白血病第21頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四流式細胞術(shù)與造血干/祖細胞計數(shù)第22頁，共24頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四原 理 造血干/祖細胞存在于骨髓和外周血中，形態(tài)與淋巴細胞相似，用普通形態(tài)學(xué)方法難于識別。但根據(jù)造血干/祖細胞的特征，可用FCM多參數(shù)分析血液、骨髓和濃縮白細胞懸液中造血干/祖細