《PCR實驗技術》13 目的基因PCR擴增產(chǎn)物的克隆

1、目的基因PCR擴增產(chǎn)物的克隆 實驗原理1.PCR產(chǎn)物回收在高離子鹽存在的情況下，DNA片斷選擇性的吸附于離心柱內的硅基質膜上，再通過一系列快速的漂洗、離心的步驟去蛋白液和漂選液，將引物、核苷酸、蛋白酶等雜質去除，最后用低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質膜上洗脫。2.T載體與PCR產(chǎn)物的連接源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將

2、兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點，所以切割時出現(xiàn)兩種可

3、能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進行，這樣就導致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對載體進行5除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3OH末端與5端，所以除磷后載體不會自環(huán)。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自身成環(huán)造成的高本底。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。連接反應的溫度在37時有利于連

4、接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與T -Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質粒。實驗材料、試劑和儀器PCR擴增相關試劑、PCR儀、移液槍、低溫離心機、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、pUCm-T載體。實驗步驟10PCR Buffer2.5 ldNTPs0.5 lTaq0.2 l引物11.5 l引物21.5 lddH2017.3 lD

5、NA模板1.5 l1PCR擴增PCR反應體系： 注：每組做5管，其中4管用于PCR產(chǎn)物回收，1管作電泳檢測時的對照PCR反應程序：194預變性5min294變性45s360退火30s472延伸60s24步驟，35循環(huán)572延伸10min64保存2目的基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測（1）制備瓊脂糖凝膠稱取0.2g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入20ml 1.0TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液。（2）取有機玻璃內槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好（一定封嚴，不能留縫隙）。（3）將有機玻璃內槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。（4）將冷到60

6、左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。（5）待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內。（6）加入電泳緩沖液至電泳槽中。（7）用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔中（記錄點樣順序及點樣量）。（8）接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。3產(chǎn)物回收（1）在紫外光下將瓊脂糖凝膠上的目的片段切下，放入1.5 mL Eppendorf離心管中；加入500l溶膠/結合液DB，充分混勻。（2）將上一

7、步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置1 min，12000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液。（3）加入700l漂洗液WB，12000rpm離心1min，棄掉廢液。（4）加入500l漂洗液WB，12000rpm離心1 min，棄掉廢液。（5）將吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm離心2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。（6）取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50l洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70水浴中加熱效果更好），室溫放置2 min，12000rpm離心1 min。如果需要較多量DNA，可將得到

8、的溶液重新加入離心吸附柱，離心1 min。4PCR產(chǎn)物與T載體的連接對于常規(guī)的DNA ligase連接反應，請參考下面的連接反應體系，或按DNA ligase的說明書進行操作。每個連接反應使用1l pMD 18-T載體，約0.2pmol PCR產(chǎn)物，在10l連接體系中4連接過夜或室溫連接1h。T4 DNA Ligase Buffer(2X) 5lPurified PCR Product 1lpMD 18-T Vector 1lT4 DNA Ligase (5-10U/微升) 1lddH2O up to 10l5. 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法) 挑取新鮮的E.coli.DH5單菌落接種于

9、一個含有10 ml LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素）的試管中，于37恒溫振蕩（200 rpm）培養(yǎng)約4h(OD=0.20.4)，取出后立即將其冰浴10min。 在無菌條件下將冰浴后的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml無菌離心管中，于4下10000g離心1min，回收細菌。 每管中加入500 l于4下預冷的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，于4下10000g離心1min，回收細菌沉淀物。 每管加入200 l冰預冷的CaCl2，混勻即為感受態(tài)細胞，置4冰箱備用。6. 重組質粒轉化大腸桿菌 取10 l連接產(chǎn)物，加入內裝100 l感受態(tài)細胞的離心管中，輕彈管壁混勻，冰浴30 min。 42熱擊90s后，迅

10、速將離心管冰浴35min。 加入1 ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻，于37 下振蕩培養(yǎng)（180 rpm）45 min。 4下，10000 g，離心1 min，吸出500 l上清液棄去，再混勻，取200 l涂布于含有100 g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上（事先涂布4l濃度為200 mg/mg IPTG和20l濃度為40 mg/ml X-gal），待菌液被培養(yǎng)基完全吸收后，倒置平板于37培養(yǎng)1216h，直至出現(xiàn)單菌落。再將培養(yǎng)皿置于4，使其完全顯色（即出現(xiàn)藍、白斑）。 連接產(chǎn)物轉化實驗的同時，以等體積的ddH2O代替連接產(chǎn)物，其操作同上，分別涂布于含抗生素和不含抗生素的LB平板上，分別作為陰性對照和陽性對照。7. 重組子克隆的鑒定（本部分視實驗進程而定）挑取可能含有目的片段的白斑，接種到5