黑果腺肋花楸果微乳系統(tǒng)薄層色譜分析及生物自顯影抗氧化活性研究

1、PAGE 12 -黑果腺肋花楸果微乳系統(tǒng)薄層色譜分析及生物自顯影抗氧化活性研究黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa(Michx.)Elliott)，又稱不老莓，最早起源于北美東北部，20世紀(jì)90年代引入我國，在食用、藥用、園林、生態(tài)方面均應(yīng)用廣泛1，2022年9月國家衛(wèi)健委正式批準(zhǔn)黑果腺肋花楸果為新食品原料2。黑果腺肋花楸果實中主要化學(xué)成分為原花青素、花色苷、黃酮、酚酸等3，據(jù)報道黑果腺肋花楸果實中花青素、黃酮、多酚含量遠(yuǎn)超其他漿果，甚至是已知植物中含量最高的4。近年來發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸果實及提取物在抗氧化、抗突變、抗炎、抗腫瘤，抗糖尿病以及防治心血管疾病等方面都有顯著作用5-8。已

2、有文獻(xiàn)報道了采用pH示差法9，高效液相色譜10測定黑果腺肋花楸果中花色苷含量；紫外可見分光光度法11測定總黃酮含量；Folin-Ciocalteu法12測定酚酸類成分，但是到目前為止，還未見高效薄層色譜法同時測定黑果腺肋花楸果中花色苷、黃酮、酚酸類成分的報道。微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相按適當(dāng)比例自發(fā)生成的有增溶作用的熱力學(xué)穩(wěn)定體系13，以微乳液為展開劑進(jìn)行的薄層色譜分析稱為微乳色譜，目前已應(yīng)用于黃酮、皂苷、生物堿和多糖類等成分的分離鑒定14。聚酰胺分子中的酰胺鍵可與酚類、酸類、醌類等化合物形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附解析，因此聚酰胺薄膜已成為黃酮類、酚類、有機(jī)酸、生物堿類等薄層分

3、析方法中的常用固定相15。本研究在前期實驗中考察了傳統(tǒng)硅膠薄層色譜和聚酰胺薄膜結(jié)合微乳系統(tǒng)薄層色譜，發(fā)現(xiàn)聚酰胺薄膜結(jié)合微乳系統(tǒng)薄層色譜比傳統(tǒng)硅膠薄層色譜靈敏度和分離效率要高，重現(xiàn)性好。因此本研究采用聚酰胺-微乳薄層系統(tǒng)結(jié)合高效薄層色譜法(highperformancethinlayerchromatography，HPTLC)，測定黑果腺肋花楸果中多種成分含量，通過紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visiblespectroscopy,UV-Vis)測定其對DPPH自由基的清除能力，通過薄層生物自顯影技術(shù)判定抗氧化活性成分。1材料與方法1.1儀器與設(shè)備半自動點樣儀、SCANNER

4、3型薄層色譜掃描儀、薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)，瑞士CAMAG；超聲波清洗儀(150W，40kHz)，昆山市超聲儀器有限公司；萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。1.2材料與試劑黑果腺肋花楸果凍干粉，經(jīng)鑒定為薔薇科腺肋花楸屬植物黑果腺肋花楸的果實，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，C3G)、金絲桃苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷(cyanidin-3-O-arabinofuranoside，C3A)，北京索萊寶科技有限公司；綠原酸、新綠原酸、維生素C，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼，梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展

5、有限公司；其余實驗所用試劑均為分析純。1.3薄層掃描方法1.3.1溶液的制備1.3.1.1C3G、金絲桃苷、綠原酸對照品溶液的制備精密稱取C3G、金絲桃苷及綠原酸對照品適量，加甲醇定容至容量瓶中，配成C3G、金絲桃苷、綠原酸系列質(zhì)量濃度分別為89.42、149.04、248.40、414.00、690.00g/mL；5.42、9.03、15.05、25.08、41.80g/mL；25.79、42.98、71.64、119.40、199.00g/mL的混合溶液，搖勻后經(jīng)0.22m濾膜過濾后作為對照品溶液。1.3.1.2供試品溶液的制備稱取黑果腺肋花楸果凍干粉1.00g，置棕色容量瓶中，以60%甲

6、醇(經(jīng)0.5%HCl調(diào)節(jié)pH至23)為溶劑，料液比110(gmL)，40條件下超聲提取30min，冷卻至室溫后過濾，濾液經(jīng)0.22m濾膜過濾后作為供試品溶液。1.3.2色譜程序使用CAMAGLinomat5半自動斑點采樣器，對聚酰胺薄膜條狀點樣，采樣器的載氣為N2，釋放速率為150nL/s，對照品與供試品溶液均為2L，帶長6mm，軌道距離8mm，左右邊距50mm，條帶間距9mm。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%含水量微乳-甲酸(91，mLmL)為展開劑，在展開缸中飽和10min后展開，取出，晾干，花色苷類成分在白光下檢視，黃酮類，酚酸類成分先噴2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl

7、borate，2-APB)甲醇溶液，后噴聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)400甲醇溶液，105加熱后置于366nm紫外燈下檢視。使用Reprostar3薄層色譜儀分別在白光和366nm紫外燈下檢查和捕獲樣品圖像。使用CAMAGTLC3掃描儀對對照品和樣品進(jìn)行全波長掃描，距底部的擴(kuò)展距離為90和8mm，狹縫寬度為6mm0.3mm，掃描速度為20mm/s。用WinCATS4.04版本TLC在350和550nm下掃描該聚酰胺薄膜，狹縫寬度為4mm0.3mm，掃描速度為20mm/s。1.3.3方法學(xué)考察對建立的聚酰胺結(jié)合微乳系統(tǒng)薄層色譜方法進(jìn)行方法學(xué)考察，包括線性、日內(nèi)、日間精

8、密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性、回收率。1.3.4含量測定對不同批次黑果腺肋花楸果凍干粉樣品中C3G、金絲桃苷及綠原酸進(jìn)行含量測定。1.4UV-Vis法測定總抗氧化活性1.4.1溶液的制備1.4.1.1維生素C對照品溶液的制備稱取維生素C對照品6.54mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇配成質(zhì)量濃度為0.654mg/mL的對照品溶液。經(jīng)適當(dāng)稀釋分別配成6.54、13.08、19.62、26.16、39.24、52.32、65.40g/mL的溶液。1.4.1.2供試品溶液的制備根據(jù)實驗需要將1.3.1.2中供試品溶液經(jīng)稀釋配成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/

9、mL的供試品溶液。1.4.1.3DPPH溶液的制備稱取DPPH對照品4.52mg，置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇配成質(zhì)量濃度為0.0452mg/mL的溶液。1.4.2DPPH自由基清除率測定吸取3mLDPPH溶液與1mL甲醇混勻后，在最大吸收波長516nm處測定吸光度A0；吸取DPPH溶液3mL加入系列對照品或供試品溶液1mL混勻，避光反應(yīng)0.5h后，在516nm處測定吸光度Ai；空白為甲醇3mL與相對應(yīng)系列對照品或供試品溶液1mL混勻，避光反應(yīng)0.5h后在516nm處測定吸光度Aj，按公式(1)計算清除率(S)。(1)1.5薄層生物自顯影(TLCBiography,TLC-Bio)分析黑

10、果腺肋花楸果提取物中抗氧化活性成分1.5.1溶液的制備精密稱取C3A，新綠原酸對照品適量，加甲醇配成質(zhì)量濃度為0.2、0.263mg/mL對照品溶液。1.5.2TLC-Bio測定黑果腺肋花楸果提取物中抗氧化活性成分分別吸取C3G、C3A、新綠原酸、金絲桃苷、綠原酸混合對照品溶液，黑果腺肋花楸供試品溶液各2L，按1.3.2方法操作，點樣于a，b兩張聚酰胺薄膜后，展開取出，晾干，不進(jìn)行掃描。將聚酰胺薄膜a先在白光下檢視，再噴顯色劑，先噴2-APB，后噴PEG400，晾干后置紫外366nm光下檢視，聚酰胺薄膜b晾干后直接噴DPPH甲醇溶液，直到呈現(xiàn)紫色背景，在白光下檢視。2結(jié)果與分析2.1薄層掃描最

11、大吸收波長的確定掃描儀對對照品和供試品進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸果供試品溶液斑點與對照品斑點比移值相同，光譜圖最大吸收波長一致(圖1)，C3G為550nm，綠原酸為340nm，金絲桃苷為370nm，且波形一致，可以認(rèn)為是同一物質(zhì)。綠原酸與金絲桃苷在350nm處均有較大吸收，后續(xù)實驗采用雙波長法分別在350、550nm處對綠原酸，金絲桃苷和C3G進(jìn)行分析。a-C3G；b-金絲桃苷；c-綠原酸圖1最大吸收光譜和化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1Themaximumabsorptionspectrumandchemicalstructure2.2方法學(xué)結(jié)果2.2.1線性分別吸取1.3.1.1中C3G、金絲桃苷及綠

12、原酸系列濃度對照品溶液，按1.3.2方法操作，以濃度為x軸，峰面積為y軸，得到對照品C3G，金絲桃苷，綠原酸的線性回歸方程，見表1。表1方法的線性關(guān)系考察表Table1Methodoflinearrelationinvestigationtable2.2.2日內(nèi)間精密度分別吸取C3G、金絲桃苷及綠原酸的低、中、高濃度對照品溶液，各重復(fù)3次點于聚酰胺薄膜上，按1.3.2方法操作，測定C3G、金絲桃苷、綠原酸峰面積計算日內(nèi)間精密度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示。日內(nèi)和日間精密度的RSD值如表2所示，結(jié)果表明精密度良好。表2日內(nèi)、日間精密度考察表T

13、able2Intradayandinter-dayprecisioninvestigationtable2.2.3穩(wěn)定性按1.3.2方法操作，吸取混合對照品溶液點樣(n=6)于同一聚酰胺薄膜上，分別記錄C3G、金絲桃苷、綠原酸在0、2、4、6、8、12、24h內(nèi)峰面積并計算RSD，見表3，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好，C3G、金絲桃苷、綠原酸RSD均3%。表3穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table3Stabilitytestresults2.2.4重復(fù)性按1.3.1.2提取同一批黑果腺肋花楸凍干果粉溶液(n=6)，按1.3.2方法操作，記錄供試品中C3G、金絲桃苷、綠原酸峰面積，經(jīng)計算RSD均3%，重復(fù)性試驗符合要求

14、(表4)。表4重復(fù)性試驗結(jié)果Table4Repeatabilitytestresults2.2.5耐用性按1.3.2方法操作，改變試驗條件包括流動相比例(0.1mL)、飽和時間(2min)、掃描波長(2nm)，記錄峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation，SD)和RSD。通過對展開劑比例、飽和時間、掃描波長進(jìn)行輕微變動考察發(fā)現(xiàn)RSD均3%，結(jié)果見表5。表5耐用性試驗結(jié)果Table5Durabilitytestresults2.2.6回收率分別吸取供試品溶液適量，加入相當(dāng)于C3G、金絲桃苷、綠原酸0.263、0.1055、0.568mg的對照品溶液，混合均勻。按1.3.2方法操作，結(jié)果

15、見表6，C3G、金絲桃苷、綠原酸平均回收率分別為100.6%、100.0%、99.4%；RSD分別為3.4%、2.6%、2.9%，表明該方法回收率良好。表6回收率試驗結(jié)果Table6Recoverytestresults2.3含量測定按1.3.1.2制備不同批號黑果腺肋花楸凍干果粉溶液(n=3)，吸取4批供試品溶液點于同一聚酰胺薄膜上，通過對比對照品C3G、金絲桃苷和綠原酸與樣品中相應(yīng)斑點的Rf值(分別為0.42、0.33、0.51)確定供試品中相應(yīng)峰，采用外標(biāo)法測定4批供試品中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量(圖2、表7)。S-混標(biāo)：A-C3G；B-綠原酸；C-金絲桃苷；S1S4：四批黑果腺肋花

16、楸果圖2四批黑果腺肋花楸果薄層色譜圖Fig.2Thin-layerchromatogramoffourbatchesofblackchokeberry表7樣品含量測定結(jié)果單位：mg/gTable7Resultsofsamplecontentdetermination2.4DPPH自由基清除率結(jié)果2.4.1不同濃度維生素C對DPPH自由基的清除率由表8可知，維生素C清除50%DPPH自由基質(zhì)量濃度約在14g/mL，從圖3看出維生素C對DPPH自由基的清除能力與濃度相關(guān)，一定范圍內(nèi)DPPH自由基清除率隨維生素C濃度增加而增大。文獻(xiàn)也多用此方法測定抗氧化能力，一定程度上表明本方法測定抗氧化能力是可行

17、的。2.4.2不同濃度黑果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除率由表9可知，黑果腺肋花楸果提取物濃度約為0.18mg/mL能清除50%的DPPH自由基，從圖4可看出，清除率隨黑果腺肋花楸果提取物濃度增大而增加，濃度達(dá)1.2mg/mL時，清除率為95.90%。表8維生素C對DPPH清除結(jié)果Table8TheDPPHscavengingrateofvitaminC圖3維生素C對DPPH自由基的清除曲線Fig.3TheVcscavengingabilitytowardDPPH表9黑果腺肋花楸果對DPPH清除結(jié)果Table9TheDPPHscavengingrateofblackchokeberry圖4黑

18、果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除曲線Fig.4ScavengingabilityofblackchokeberrytowardDPPH2.5TLC-Bio分析黑果腺肋花楸的抗氧化活性成分由圖5可知，薄層板無抗氧化活性，呈紫色背景，而對照品和供試品顯現(xiàn)黃白色斑點，顯示具有良好的抗氧化活性，說明黑果腺肋花楸中C3G、C3A、金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸都有不同程度的抗氧化活性，除此之外供試品中還含有其他未知抗氧化活性成分，有待于進(jìn)一步分離鑒定。a-普通色譜圖(白光；紫外366nm)；b-生物自顯影色譜圖A-C3G；B-C3A；C-新綠原酸；D-綠原酸；E-金絲桃苷圖5生物自顯影色譜圖Fig.5TLC-Biochromatograms3結(jié)論與討論文獻(xiàn)報道了黑果腺肋花楸果富含花色苷、黃酮、酚酸類成分，前期實驗先采用硅膠薄層色譜與聚酰胺-微乳薄層色譜鑒別指認(rèn)了其中含有C3G、金絲桃苷、綠原酸、蘆丁，發(fā)現(xiàn)聚酰胺-微乳薄層色譜斑點清晰，分離度高，因此本研究采用聚酰胺-微乳薄層系統(tǒng)結(jié)合高效薄層色譜建立同時測定黑果腺肋花楸果實中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量的方法，4批黑果腺肋花楸果粉中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量分別在2.0283.886，0.0920.155和0.6531.058mg/g，該方法樣品制備簡單，對所得數(shù)