多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第1頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二一、實(shí)驗(yàn)原理：PCR又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即在高溫下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，Mg2+存在下，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)

2、行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以指數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過2530個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增數(shù)百萬倍。第2頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二DNA模板：反應(yīng)中DNA量在50ng200ng左右。且DNA純度較高， 以增加反應(yīng)特異性。dNTP:反應(yīng)體系中達(dá)100M200M。Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低。引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計(jì)。引物約20堿基左右；G+C含量在4070之間；引物內(nèi)部不能有回該序列；

3、引物端不能互補(bǔ)。Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，在95時(shí)30分鐘還有50活力。說明第3頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二PCR過程示意圖第4頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二 二、實(shí)驗(yàn)所需器材和試劑器材：臺式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，PCR擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf離心管，PCR小管 第5頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二試劑：引物1，引物2，dNTP mix，10X PCR Buffer，Taq DNA 聚合酶，EB，上樣緩沖液，marker，瓊脂糖，TBE緩沖液第6頁，共1

4、3頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二三、實(shí)驗(yàn)步驟1：加樣按次序在PCR小管中加入下列試劑（50ul體系）： 5ul 10X PCR Buffer 4ul dNTP mix 2ul 引物1 2ul 引物2 3ul 模板 1ul Taq DNA polymerase 加水到總體積50ul第7頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二第8頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二注意事項(xiàng)：同時(shí)設(shè)立對照組（對照組不加模板DNA）第9頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二2、按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（對于不同的PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)置不同的反應(yīng)條件）94 4分鐘94 30秒51 30秒 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)72 30秒72 5分鐘4 第10頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二將實(shí)驗(yàn)組與對照組放入PCR儀，按設(shè)定好的條件進(jìn)行擴(kuò)增第11頁，共13頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)16分，星期二3、擴(kuò)增結(jié)束后，取5ul產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以觀察結(jié)果PCR結(jié)果示意圖第12頁，共13頁，2022年，5月20日