堿裂解法提取質(zhì)粒

1、堿裂解法提取質(zhì)粒第1頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五 通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測定，學習用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理及操作。一、實驗目的第2頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五質(zhì)粒(Plasmid) ：質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。 在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。二、實驗原理第3頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五第4頁

2、，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，具有以下特點： 易于鑒定； 在受體細胞中可以獨立復制； 易于篩選； 易于導入受體細胞。 第5頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五二、實驗原理高堿細菌的細胞壁破裂，內(nèi)容物釋放染色體DNA斷裂成不同長度的線性雙鏈DNA；線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；雙鏈DNA并不完全分離。高酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化RNA酶消化除去RNA，并

3、用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)第6頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五 SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性(NaOH)環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細菌中提取出來。第7頁，共12頁，2022年，5月20日，10

4、點0分，星期五三、主要試劑及作用溶液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成 (保護、緩沖)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的 機械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒 (保護作用)EDTA 的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子, 防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用（保護作用）Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）8第8頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成(裂解、變性)SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂解細胞和蛋白質(zhì)變性作用）NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（

5、DNA變性作用）9第9頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五溶液III：HAc和 KAc組成的高鹽溶液 (復性，分離)HAc溶液能中和溶液的堿性，使染色體DNA 變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復性。KAc會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS復合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。第10頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五四、試劑配制 溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M E

6、DTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min ，貯存于4。 溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。 3. 溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存?zhèn)溆?。?1頁，共12頁，2022年，5月20日，10點0分，星期五4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?5. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（無水乙醇、70%乙醇） 7. 5TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?8. RNa