淫羊藿總黃酮對金屬離子刺激單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子的影響

1、淫羊藿總黃酮對金屬離子刺激單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子的影響【摘要】目的通過觀察淫羊藿總黃酮(ttalflavnesfEpiediu,TFE)對金屬離子(2+)刺激單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-(TNF-)的影響,討論TFE抑制TNF-分泌的機(jī)制以及防治關(guān)節(jié)假體的無菌性松動的可能性。方法采集36例安康志愿者的外周血,別離單核細(xì)胞,分組培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分成6組。A組:僅單核細(xì)胞;B組:單核細(xì)胞+金屬離子;組:單核細(xì)胞+金屬離子+帕米膦酸鈉10g/L;D組:單核細(xì)胞+金屬離子+TFE5g/L;E組:單核細(xì)胞+金屬離子+TFE10g/L;F組:單核細(xì)胞+金屬離子+TFE20g/L。單核細(xì)胞培養(yǎng)48h后,ELISA

2、法測定細(xì)胞上清液中TNF-的含量。結(jié)果B組TNF-的含量明顯高于A組(P0.01);、D、E、F組TNF-的含量分別明顯低于B組(P0.01);D、E組之間及E、F組之間TNF-的含量差異均有顯著性(P0.05)。結(jié)論金屬離子可刺激單核細(xì)胞使其分泌溶骨性因子TNF-的量增加。TFE與帕米膦酸鈉作用效果相似,可降低溶骨性細(xì)胞因子TNF-的分泌,隨著TFE濃度的增加,其降低TNF-分泌量的作用加強(qiáng)，從而有望成為防治關(guān)節(jié)假體松動的藥物之一。【關(guān)鍵詞】淫羊藿總黃酮;二膦酸鹽;金屬離子;骨溶解;假體松動Abstrat:bjetiveBybservingtheeffetfttalflavnesfEpied

3、iu(TFE)nseretingTNF-duetstiulatinfhuannytesbyetalinbalt(2+),tdisusstherlefTFEindereasingtheseretinfTNF-,prvidingatheretialsupprtfrusingtheherbalediinetpreventandtreataseptilseningfjintprsthesis.ethdsBldsaplesbtainedfr30healthyhuandnrserepressedtgetthenytestperfrthepresentexperientin6grups.grupA:ntai

4、ningnytesnly;grupB:nytes+etalin;grup:nytes+etalin+paidrnate10g/L;grupD:nytes+etalin+TFE5g/L;grupE:nytes+etalin+TFE10g/L;andgruF:nytes+etalin+TFE20g/L.Theixturesereulturedfr48htdeterinethenentratinfTNF-byELISA.ResultsThelevelfTNF-asuhhigheringrupBthaningrupA,D,EandF(P0.01).Thereassignifiantstatistial

5、differenebeteengrupDandgrupE(P0.05)andbeteengrupEandgrupF(P0.05).nlusinBEingstiulatedbyetalin,nytesansereteTNF-.TheinhibitryeffetfTFEissiilartthatfpaidrnate,andisprprtinaltthenentratinfTFE.ItseesthatTFEanbeaptentialtherapeutiagentfrthepreventinandtreatentfaseptilseningfjintprsthesis.Keyrds：ttalflavn

6、esfEpiediu;bisphsphnate;etalin;stelysis;prsthesisfailure人工關(guān)節(jié)置換目前已廣泛應(yīng)用于臨床。人工關(guān)節(jié)磨損顆粒能刺激巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞產(chǎn)生大量溶骨性因子，包括腫腫瘤壞死因子(TNF-)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)等,這些溶骨性因子能刺激破骨細(xì)胞產(chǎn)生骨溶解,最終導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)無菌性松動1-3。文獻(xiàn)報道淫羊藿總黃酮(ttalflavnesfEpiediu，TFE)可以抑制TNF-的基因表達(dá),從而到達(dá)抗骨質(zhì)疏松的作用4。本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)將單核細(xì)胞、金屬離子、二膦酸鹽類藥物帕米膦酸鈉、TFE共同培養(yǎng),觀察TFE對金屬離子誘

7、導(dǎo)的溶骨性因子TNF-釋放的影響。1資料和方法1.1樣本采集36例安康獻(xiàn)血者。男18例,女18例,年齡3968歲,平均52.8歲。每例采集外周血10l肝素抗凝。1.2試劑和器材TFE(沈陽藥科大學(xué)),帕米膦酸鈉(南京正大天晴制藥),l2粉末(南康化學(xué)儀器公司),RPI-1640培養(yǎng)基(丹麥GIB公司),6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(rning公司),胎牛血清(杭州四季青公司),TNF-放射免疫試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所),二氧化碳培養(yǎng)箱(美國FraSientifi公司)。1.3方法及分組無菌采集外周血以Hank液稀釋1倍,分層液梯度離心法別離出單核細(xì)胞。洗滌3次,加含10%胎牛血清的RPI1640培養(yǎng)液

8、制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4108/L,錐蟲藍(lán)排除法檢測細(xì)胞活力均大于95%。6孔培養(yǎng)板中滴加細(xì)胞懸液,每孔加3l，置37、5%2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h,使細(xì)胞貼壁,洗去非貼壁細(xì)胞,留下單核細(xì)胞。每板第1孔內(nèi)參加含10%的胎牛血清的RPI1640培養(yǎng)液3l，其余5孔參加終末濃度為10g/Ll2溶液3l，并于第3孔參加帕米膦酸鈉使其濃度為10g/L,于第4、5、6孔參加TFE使其濃度分別為5g/L、10g/L、20g/L。即第1孔為僅有單核細(xì)胞的對照組(A組),第2孔為單核細(xì)胞+金屬離子組(B組),第3孔為單核細(xì)胞+金屬離子+帕米膦酸鈉10g/L(組),第4孔為單核細(xì)胞+金屬離子+TF

9、E5g/L(D組)，第5孔為單核細(xì)胞+金屬離子+TFE10g/L(E組)，第6孔為單核細(xì)胞+金屬離子+TFE20g/L(F組)。各組同條件培養(yǎng)48h,取上清液,測定上清液中的TNF-含量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以s表示,采用SSPS13.0軟件包行方差分析和q檢驗(yàn)。P0.05為差異有顯著性。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果6種不同處理組上清液中TNF-含量的比擬見表1。方差分析顯示,6組細(xì)胞上清液中TNF-含量差異有顯著性(F=3495,P0.01)。兩兩比擬顯示,B組TNF-含量明顯高于A組(P0.01),說明金屬離子可以刺激單核細(xì)胞使TNF-的分泌量增加;、D、E、F組TNF-含量分別明顯低于B

10、組(P0.01),D、E組TNF-含量分別與組之間的差異無顯著性(P0.05),說明帕米膦酸鈉和TFE均能降低TNF-的分泌量;D、E、F組兩兩之間TNF-含量差異均有顯著性(P0.05),說明隨著TFE濃度的增加,對TNF-分泌量的抑制作用增強(qiáng)。表1各組細(xì)胞上清液中TNF-含量的比擬3討論迄今為止,不管假體設(shè)計(jì)得多么完美,所有類型人工關(guān)節(jié)的承重面都產(chǎn)生磨損顆粒5。磨損微粒激活巨噬細(xì)胞分泌大量溶骨性因子,溶骨性因子刺激破骨細(xì)胞產(chǎn)生骨溶解,最終導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)的無菌性松動,TNF-、IL-1和IL-6是參與其中的主要溶骨性因子。Nakashia等6在體外研究中發(fā)現(xiàn),暴露于鈦合金微粒下48h的巨噬細(xì)胞

11、,其TNF-、IL-6的釋放量分別增加了40倍和7倍。干預(yù)這些溶骨性因子以尋求防治關(guān)節(jié)松動的藥物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過人外周血與金屬離子混合培養(yǎng)亦發(fā)現(xiàn)金屬離子可以刺激單核細(xì)胞分泌大量的TNF-,證明金屬離子在關(guān)節(jié)松動中有重要的作用。二膦酸鹽類藥物因其在防治骨質(zhì)疏松和腫瘤性骨溶解方面的成功應(yīng)用,而被用來治療關(guān)節(jié)無菌性松動。近年來的研究說明,西藥二膦酸鹽類可以有效抑制磨損微粒介導(dǎo)的骨質(zhì)吸收7。TFE是我國傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯骨中藥淫羊藿的主要成分之一。淫羊藿不但可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡,抑制骨吸收,減少骨量喪失,同時可促進(jìn)體外成骨細(xì)胞增殖及分化成熟8。近年來,國外學(xué)者先后從豆科植物中提取到了具有抗骨質(zhì)疏

12、松作用的黃酮類化合物或衍生物9-10。人工關(guān)節(jié)無菌性松動的溶骨機(jī)制與骨質(zhì)疏松的骨量喪失有很大的相似性,TFE在治療骨質(zhì)疏松方面的作用已得到充分的肯定,而且其來源廣泛,價格低廉,副作用少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測外周血TNF-含量發(fā)現(xiàn),當(dāng)單參加金屬離子時細(xì)胞上清液中TNF-的含量較其他組為最高,這說明金屬離子可以刺激TNF-的分泌。而參加帕米膦酸鈉或TFE后細(xì)胞上清液中TNF-的含量明顯下降,說明TFE與帕米膦酸鈉作用效果相似,可以抑制細(xì)胞因子TNF-的分泌,且隨著TFE濃度的增加其抑制作用加強(qiáng)。說明TFE可以抑制這種刺激作用,抑制溶骨因子分泌,從而對人工關(guān)節(jié)遠(yuǎn)期松動具有一定的預(yù)防作用。【參考文獻(xiàn)】1Gd

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