百草枯對木質(zhì)素降解菌產(chǎn)酶及其生物化學(xué)變化的影響

1、 可修改 歡送下載 精品 Word 可修改 歡送下載 精品 Word 可修改 歡送下載 精品 Word百草枯對木質(zhì)素降解菌產(chǎn)酶及其生物化學(xué)變化的影響1 南京大學(xué)生命科學(xué)院 國家醫(yī)藥重點實驗室, 南京 2100932 河西學(xué)院農(nóng)學(xué)系, 張掖 7340003 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南京 210046摘 要: 為研究外源活性氧對木質(zhì)素降解菌的影響, 本實驗對外源百草枯誘導(dǎo)下的雜色云芝(Coriolus versicolor)產(chǎn)酶及其生物化學(xué)過程進行了研究。將一定濃度的百草枯參加培養(yǎng)7 d的雜色云芝菌培養(yǎng)液中, 連續(xù)培養(yǎng)148 h, 測定其胞外木質(zhì)素降解酶、胞內(nèi)抗氧化酶的活性及生物化學(xué)參數(shù)的變化

2、。與對照相比, 30 mol/L的百草枯能夠顯著促進雜色云芝錳依賴過氧化物酶(MnP)、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和漆酶(Lac)的活性, 3種酶活性分別提高了1.3、7和2.5倍; 在連續(xù)培養(yǎng)的前48 h, 30 mol/L的百草枯促進了胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性。百草枯對于胞外木質(zhì)素降解酶活性的促進作用比對胞內(nèi)抗氧化酶活性的促進作用明顯。百草枯的參加促進了胞外酚類化合物與甲醛的濃度的增加, 而丙二醛的濃度在培養(yǎng)的前24 h內(nèi)增加, 隨后下降。結(jié)果說明, 百草枯的參加對白腐菌產(chǎn)生了氧化脅迫, 但菌株的抗氧化系統(tǒng)能夠有效地進行氧化劑的去除, 從而阻止氧化劑對機體的

3、氧化傷害。百草枯作為外源氧化脅迫劑, 可以增加木質(zhì)素降解酶活性, 有利于木質(zhì)素的降解。關(guān)鍵詞: 雜色云芝, 百草枯, 氧化脅迫, 木質(zhì)素降解酶, 甲醛Impact of exogenous paraquat on enzyme exudation andbiochemical changes of lignin degradation fungiYunchen Zhao1,2, Jianlong Li1, Yuru Chen3, Haixia Huang1, and Zui Yu11 State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, S

4、chool of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093, China2 Department of Agronomy, Hexi University, Zhangye 734000, China3 School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, ChinaAbstract: To study the effect of exogenous oxygen, we added water solution of paraquat to 7 d cult

5、ures of Coriolus versicolor for the next 148 h. Enzyme exudation and biochemiscal process were investigated on the addition of paraquat. We found that compared with the control (without paraquat), the addition of 30 mol/L paraquat stimulated the activity of manganese dependent peroxidase (MnP), lign

6、in peroxidase(LiP), and laccases (Lac) 7, 2.5 and 1.3 times, respectively. Also, addition of paraquat enhanced activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in the first 48 h. Impact of paraquat on ligninolytic enzymes was significant than that on antioxidant enzyme. Addition of paraquat

7、 enhanced phenolic compounds and formaldehyde of cultures too. And concentration of malondialdehyde was increased in the first 24 h. The results showed that addition of paraquat promoted oxidative stress, but the antioxidant systems of the fungal strain are sufficient to prevent mycelia from oxidati

8、ve stress. As exogenous oxygen, paraquat might be a useful substrate in degradation of lignocellulose.Keywords: Coriolus versicolor, paraquat, oxidative stress, ligninolytic enzymes, formaldehyde木質(zhì)纖維類物質(zhì)被充分利用生產(chǎn)生物燃料的過程中必須先降解或別離木質(zhì)素。木質(zhì)素的降解包括化學(xué)、生物、物理或綜合處理方式。其中生物預(yù)處理具有耗能少、環(huán)境條件溫和的優(yōu)點。微生物降解木質(zhì)素的原理是利用其代謝產(chǎn)生的酶, 在

9、常溫常壓下把復(fù)雜的木質(zhì)素轉(zhuǎn)化為小分子。在木質(zhì)素的降解菌中, 白腐菌是使用最廣泛的木質(zhì)素降解菌。白腐菌能產(chǎn)生完全的木質(zhì)素降解酶體系, 從而解聚和徹底降解木質(zhì)素1。但自然條件下白腐菌產(chǎn)酶量有限, 限制了降解的完全程度。因此提高白腐菌分泌木質(zhì)素降解酶能力, 從而更有效地降解木質(zhì)素對提高木質(zhì)纖維類物質(zhì)的利用具有重要的意義。活性氧是好氧微生物進行氧代謝時產(chǎn)生的一類化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷奈镔|(zhì), 主要包括超氧陰離子自由基、過氧化氫和羥自由基等。白腐菌的木質(zhì)素降解過程與活性氧之間有很大的相關(guān)性, 活性氧是胞外木質(zhì)素降解系統(tǒng)中的一種有用的物質(zhì)2-3, 是木質(zhì)素降解的啟動因子45。正常情況下細胞自身活性氧的產(chǎn)生和去除

10、代謝是平衡的, 但當活性氧的水平超過細胞的抗氧化能力時, 對細胞產(chǎn)生氧化脅迫?；钚匝踝鳛橐环N氧化脅迫因子, 同時又參與白腐菌對木質(zhì)素的降解, 因此研究活性氧存在時白腐菌的氧化脅迫反響及相關(guān)的木質(zhì)素降解過程具有非常重要的意義。本實驗以百草枯作為外源氧化脅迫劑, 以期研究百草枯存在下白腐菌木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生情況及其生物化學(xué)反響, 為外源氧化劑與木質(zhì)素降解之間的相關(guān)性提供了一定的理論依據(jù), 為木質(zhì)素的有效降解提供了新的途徑。1 材料與方法1.1 實驗菌種雜色云芝009 (Coriolus versicolor), 購于南京林業(yè)大學(xué)菌種保藏中心。1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件PDA固體培養(yǎng)基: 馬鈴薯浸汁1

11、 L, 葡萄糖20 g/L, 瓊脂20 g/L, 120 oC滅菌20 min。PDA液體培養(yǎng)基: 馬鈴薯浸汁1 L, 葡萄糖20 g/L, 120 oC滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基: 10 mmol/L的醋酸緩沖液(pH 4.5), 內(nèi)含有葡萄糖2 g/L, 酒石酸銨12 mmol/L, KH2PO4 1.47102 mol/L, MgSO47H2O 2.03103 mol/L, CaCl22H2O 6.8104 mol/L, VB 12.97106 mol/L, 1 g吐溫80與7 mL微量元素混合液6, 120oC滅菌30 min。培養(yǎng)方法: 將斜面菌種接種于PDA固體平板培養(yǎng)基, 當菌

12、體長滿平板時用打孔器打下34片9 mm2大小的菌片, 放入PDA液體培養(yǎng)基, 于28 oC、150 r/min下培養(yǎng)至菌體長滿培養(yǎng)基外表, 用勻漿器將菌體混勻后以2.5%的接種比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基, 28 oC、150 r/min培養(yǎng)7 d。氧化脅迫條件: 百草枯添加濃度通過實驗由漆酶活性大小進行確定。本實驗所用百草枯的終濃度為30 mol/L, 于實驗開始前準備百草枯水溶液, 直接參加液體培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)148 h, 培養(yǎng)條件同上。1.3 測定液的準備所有測定在參加百草枯24、48、72、120、148 h時進行。測定前取一定體積混勻的菌體培養(yǎng)物, 將混勻物在4000 r/min下離心10

13、 min, 上清液用于胞外木質(zhì)素降解酶(錳依賴過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶), 以及低分子物質(zhì)(甲醛、丙二醛、超氧陰離子、酚類化合物)的測定。用蒸餾水清洗離心后的菌體沉淀物, 再將菌體沉入冷(3 oC4 oC)磷酸緩沖液(50 mmol/L, pH 7.4)。再用勻漿器在冰浴中保持4 oC6 oC將細胞打破, 破碎細胞于4 oC 10 000 r/min下離心10 min, 收集上清液用于胞內(nèi)抗氧化酶的測定。1.4 酶活性測定方法1.4.1 木質(zhì)素降解酶活性測定漆酶(Lac)活性測定采用Arora法7, 測定過程稍有改動。反響液中包含3.8 mL琥珀酸緩沖液、1 mL愈創(chuàng)木酚、0.2 m

14、L酶提取液, 反響完成后于450 nm處測定分光光度值的變化。木質(zhì)素過氧化物酶活性(LiP)的測定采用Tien法8, 也進行了一定的改良, 反響液中參加0.1 mL H2O2啟動反響, 310 nm測定分光光度值的改變量; 錳過氧化物酶(MnP)活性測定采用Wariishi法9, 反響用終濃度為0.1 mmol/L的H2O2啟動。酶活性的表示方法采用比活力表示為U/mg蛋白。1.4.2 抗氧化酶活性的測定超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用Marklund法10, 測定結(jié)果以對焦酚自氧化抑制的百分率表示(1 U=50%的抑制率)。過氧化氫酶(CAT)活性測定采用Aebi法11, 酶活性的表示方

15、法采用比活力表示為U/mg蛋白。1.5 小分子代謝物質(zhì)的測定甲醛濃度的測定: 采用鈉氏試劑分光光度法在410 nm下進行測定12, 測定結(jié)果代入標準曲線計算(y=0.0457x0.0039, R2=0.999)。酚化合物的測定: 采用磺銨DASA檢測法, 500 nm下測定吸光度的變化13, 測定結(jié)果代入標準曲線計算 (y=6.35x0.0213, R2=0.997)。超氧陰離子的測定: 采用菌體超氧陰離子產(chǎn)生的快速測定法, 560 nm下測定吸收值的變化(對照每毫升中含有40 L/mg的商用SOD酶)14。丙二醛含量的測定: 采用TBA法, 分光光度計檢測TBA的產(chǎn)生量15, 并消除影響因子

16、值。1.6 蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法, 以牛血清為標準品16。2 結(jié)果2.1 百草枯對菌體蛋白含量的影響外源百草枯參加后, 隨著培養(yǎng)時間的增加, 對照的菌體蛋白先下降后上升, 而百草枯處理菌體蛋白含量呈現(xiàn)先下降后上升又下降的趨勢(表1)。2.2 百草枯對木質(zhì)素降解酶活性的影響外源百草枯的參加引起了胞外木質(zhì)素降解酶活性的顯著變化。Lac活性較對照顯著增加, 最高的漆酶活性出現(xiàn)在百草枯參加后120 h, 為7 U/mg蛋白 (圖1), 除Lac活性增加外, MnP與LiP的活性也顯著增加(圖2、圖3)。最高的MnP活性在百草枯參加后48 h(約23 U/mg蛋白), 為對照

17、樣品MnP活性的7倍左右。最高的LiP活性出現(xiàn)于百草枯參加后48 h (約51 U/mg蛋白), 為對照樣品LiP活性的2.5倍。表1 不同處理時間菌體蛋白的含量Table 1 Protein of mycelia in different treatment timet (h)Protein of mycelia (mg/mL)0244872120148CK17.8617.5217.3417.5617.7117.75PQ17.7816.3216.6918.8418.5218.27Note: data was average of three replicate samples. PQ mea

18、ns paraquat, and CK means control.圖1 參加百草枯后漆酶活性的變化Fig. 1 Lac activity after PQ addition. PQ means paraquat, CK means control.圖2 參加百草枯后錳依賴過氧化物酶活性的變化Fig. 2 MnP activity after PQ addition. PQ means paraquat, CK means control.2.3 百草枯對胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響百草枯參加后前24 h, SOD的活性呈現(xiàn)增加趨勢, 24 h后開始下降, 72120 h內(nèi)低于對照。最高的SOD活性

19、出現(xiàn)在百草枯參加24 h, 為對照的1.5倍。百草枯的參加只引起適度的CAT活性的增加, CAT活性在參加后48 h內(nèi)呈現(xiàn)增加的趨勢, 最高的CAT活性出現(xiàn)在百草枯參加的48 h, 48 h后持續(xù)下降, 120 h降至低于對照。百草枯對于抗氧化酶活性的促進程度小于對木質(zhì)素降解酶活性的影響(圖4、圖5)。圖3 參加百草枯后木質(zhì)素過氧化物酶的活性Fig. 3 LiP activity after PQ addition. PQ means paraquat, CK means control.圖4 參加百草枯后超氧化物歧化酶的活性Fig. 4 SOD activity after PQ addit

20、ion. PQ means paraquat, CK means control.2.4 百草枯對超氧陰離子、甲醛含量的影響為了確定木質(zhì)素降解酶是否可以引起百草枯的氧化, 試驗對培養(yǎng)液中的超氧陰離子的水平進行了測定。與對照相比, 百草枯的參加引起了超氧陰離子水平的增加。超氧陰離子最明顯的變化量出現(xiàn)于百草枯參加后的24 h與120 h(圖6)。甲醛是需氧與厭氧生物在受到氧化脅迫的最初階段所產(chǎn)生的小分子標記物質(zhì), 甲醛的產(chǎn)生證明了氧化脅迫的產(chǎn)生。相對于對照, 百草枯參加后甲醛的濃度增加(表2)。圖5 參加百草枯后過氧化氫酶的活性Fig. 5 CAT activity after PQ additi

21、on. PQ means paraquat, CK means control.圖6 超氧陰離子水平(與對照相比)Fig. 6 SOR level after PQ addition (Compared with CK). SOR means superoxide anion radical.表2 外源百草枯參加后胞外甲醛的濃度Table 2 Concentration of extracellular formaldehyde after paraquat additiont (h)Extracellular malondialdehyde concentration (mol/mg pro

22、tein)0244872120148CK0.820.040.250.050.500.031.280.100.380.031.720.08PQ0.740.061.120.081.500.071.760.090.890.042.480.14Note: data are means SD from at least three independent experiments performed in duplicate. PQ means paraquat, and CK means control.表3 外源百草枯參加后胞外丙二醛的濃度Table 3 Concentration of extrac

23、ellular malondialdehyde after paraquat additiont (h)Extracellular malondialdehyde concentration (mol/mg protein)0244872120148CK12.91.0432.43.0562.65.0369.86.1014.21.3338.32.48PQ12.41.0651.14.0839.34.078.50.499.610.7410.31.14Note: data are means SD from at least three independent experiments performe

24、d in duplicate. PQ means paraquat, and CK means control.表4 外源百草枯參加后酚化合物的濃度Table 4 Concentration of extracellular phenols after paraquat additiont (h)Extracellular phenols concentration (g/mL)02448721201480.820.040.250.050.50.031.280.100.380.031.720.08PQ0.740.061.120.081.50.071.760.090.890.042.480.14

25、Note: data are means SD from at least three independent experiments performed in duplicate. PQ means paraquat, and CK means control.2.5 百草枯對丙二醛與酚化合物含量的影響丙二醛濃度的變化經(jīng)常被用于指示細胞膜脂過氧化的程度。為了檢測百草枯的參加是否引起了菌體的生物損傷, 本實驗對丙二醛濃度的變化進行了測定, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 相對于對照, 前24 h丙二醛的濃度顯著的增加, 24 h后, 丙二醛的濃度持續(xù)下降, 24 h后丙二醛的濃度遠遠小于對照(表3)。胞外酚化合物

26、是次級代謝的產(chǎn)物, 具有較高的抗氧化與防衰老的特性。在實驗中發(fā)現(xiàn), 百草枯的參加引起了胞外酚化合物的增加(表4)。3 討論3.1 百草枯濃度確實定活性氧的存在具有雙重的特性, 一方面自身是氧化脅迫劑, 另一方面作為啟動子促進白腐菌降解。因此氧化劑的劑量非常重要, 劑量不同, 細胞的反響、信號的傳遞、細胞死亡誘導(dǎo)相應(yīng)不同。為了有效地進行本實驗, 3.2 百草枯對白腐菌的影響3.2.1 百草枯對幾種酶活性的影響由菌體蛋白含量的變化趨勢可以看出, 百草枯的存在對漆酶起到雙重的效果, 酶蛋白含量的增加引起漆酶活性的增加; 酶蛋白含量較低時, 百草枯的存在誘導(dǎo)了漆酶的產(chǎn)生。而對于MnP與LiP, 百草枯

27、的存在引起了這2種酶的產(chǎn)生, 繼而表現(xiàn)酶活性的增加。百草枯的存在對于SOD與CAT酶也存在激活作用。在實驗過程中, 可以看出SOD、CAT的活性在148 h出現(xiàn)了一定程度的增加, 這可能與菌體在此時的生活狀態(tài)有關(guān), 培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn), 此時百草枯處理的菌體液呈現(xiàn)一定渾濁現(xiàn)象, 菌體生長呈現(xiàn)停滯, 菌體蛋白含量下降, 產(chǎn)生一定的毒害, 因此抗氧化酶的活性應(yīng)激增加。MnP增加應(yīng)該與比活力的表示有關(guān)。3.2.2 百草枯的氧化脅迫作用 雜色云芝在參加百草枯后受到的氧化脅迫增加, 主要表現(xiàn)在以下3個方面: 一是百草枯的參加增加了超氧陰離子的水平, 而超氧陰離子水平的提高證明了活性氧離子的產(chǎn)生。百草枯是一種聯(lián)

28、吡定類廣譜性除草劑, 它是超氧陰離子的特異產(chǎn)生劑17, 它截獲電子傳遞鏈中的電子被復(fù)原, 復(fù)原態(tài)的百草枯在自動氧化過程中產(chǎn)生超氧陰離子, 并可通過多條途徑產(chǎn)生毒性更強的羥自由基。為了去除活性氧, 抗氧化酶的活性相應(yīng)增加。研究說明抗氧化物酶(SOD、CAT)是細胞抵抗活性氧脅迫最直接也最有效的方式, 其活性的變化能夠最直接反映微生物細胞對氧化脅迫應(yīng)答水平的上下18-20。二是木質(zhì)素降解酶活性的增加。有研究說明, 漆酶的產(chǎn)生是微生物群體對氧化脅迫的應(yīng)激反響。本實驗中, 3種木質(zhì)素降解酶的活性都隨百草枯的參加而顯著增加, 說明木質(zhì)素氧化酶活性的增加是為適應(yīng)外源氧化脅迫劑而形成的一種策略。三是作為氧化

29、脅迫反響的標記產(chǎn)生物甲醛的濃度在試驗過程中顯著增加。3.2.3 白腐菌的抗氧化系統(tǒng)實驗證明, 白腐菌種的抗氧化酶系統(tǒng)能夠使菌體受到的活性氧脅迫保持在一個較低的水平, 使細胞不受到進一步的氧化傷害?？寡趸府a(chǎn)生的機制是基于去除有毒活性氧而產(chǎn)生的, 微生物不能夠長久處于外源氧化脅迫中, 為防止長時間暴露于氧化劑而導(dǎo)致的細胞傷害, 菌體必須進行快速脫毒反響, 這表現(xiàn)在抗氧化酶與抗氧化物的產(chǎn)生, 而抗氧化酶的過量產(chǎn)生需要能量。因此當外源氧化劑被去除后, 抗氧化酶活性下降以降低能量消耗。SOD是專性去除超氧陰離子而產(chǎn)生的, 在本實驗中, 48 h后SOD的活性發(fā)生了很明顯的下降, 說明超氧陰離子對細胞的

30、傷害水平下降。另外丙二醛濃度的下降也說明細胞所受到的膜脂過氧化程度降低。因此在本實驗中, 菌種抗氧化物酶能夠充分去除活性氧脅迫, 使活性氧處于較低水平, 從而免除細胞進一步的 損傷。3.3 百草枯在木質(zhì)纖維類物質(zhì)降解中的作用由于木質(zhì)素降解酶與木質(zhì)素的降解有很大的相關(guān)性, 因此木質(zhì)素降解酶的增加, 都會引起較多的木質(zhì)素分解21。因此, 希望提高木質(zhì)素降解酶的活性, 增加木質(zhì)素降解率。熱激、化學(xué)試劑、過氧化氫等對木質(zhì)素降解酶的活性具有調(diào)節(jié)作用22-23。在由MnP與LiP參與的反響中, H2O2參與木質(zhì)素單元的氧化反響并且在木質(zhì)素的解聚過程中釋放化合物。超氧陰離子可以與Mn2+反響產(chǎn)生Mn3+,

31、還能與由木質(zhì)素氧化酶產(chǎn)生的分子進行反響, 從而產(chǎn)生解環(huán)或脫木素反響。一方面, 在生物解聚與生物降解中木腐菌需要活性氧來調(diào)節(jié)過氧化物酶的產(chǎn)生, 另一方面, 活性氧又會促進木質(zhì)素降解酶活性的提高。因此, 外源百草枯脅迫使菌體產(chǎn)生較高的木質(zhì)素降解酶活性的現(xiàn)象可以作為一種有效手段運用于木質(zhì)素的降解過程, 可以通過對活性氧的有效控制來提高對木質(zhì)素的降解效率。4 結(jié)論綜上所述, 外源百草枯可以有效地調(diào)節(jié)雜色云芝木質(zhì)素降解酶與抗氧化酶的活性, 使木質(zhì)素降解酶的活性增加, 抗氧化酶的活性在參加百草枯后前48 h增加; 百草枯對木質(zhì)素降解酶的影響大于對抗氧化物酶的影響。菌體酚類化合物、丙二醛的濃度也發(fā)生了相應(yīng)的

32、變化。菌株的抗氧化系統(tǒng)能夠充分的阻止外源氧化脅迫, 因此, 在本實驗條件下, 百草枯是一種有效的氧化脅迫劑, 可以用來調(diào)控木質(zhì)素降解酶活性, 從而為有效進行木質(zhì)素降解效勞。REFERENCESSchwarze FWMR, Engels J, Matthech C. Pilz-Strategie von Holz-Verfall in den Bumen. Heidelberg, Berlin, Springer, 2000.Hammel KE, Kapich AN, Jensen Jr KA, et al. Reactive oxygen species as agents of wood d

33、ecay by fungi. Enzyme Microb Technol, 2002, 30: 445453.Gillen F, Munoz C, Gomez-Toribo V, et al. Oxygen activation during oxidation of metoxyhydroquinones by laccase from Pleurotus eryngii. Appl Environ Microbiol, 2000, 66: 170175.Keyser P, Kirk TK, Zeikus JG. Ligninolytic enzyme system of Phaneroch

34、aete chrysosporium: synthesized in the absence of lignin in response to nitrogen starvation. J Bacteriol, 1978, 135: 790797.Kirk TK, Croan S, Tien M. Production of multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporium: effect of selected growth conditions and use of a mutant strain. Enzyme Microb Techn

35、ol, 1986, 8: 2732.Collinson LP, Dawes IW. Inducibility of the response of yeast cells to peroxide stress. J Gen Microbiol, 1992, 138: 329335.Arora DS, Sandhu DK. Laccase production and wood degradation by a white-rot fungus Daedalea flavida. Enzyme Microb Technol, 1985, 7: 405408.Tien M, Kirk TK. Li

36、gnin degrading enzymes from Phanerochaete chrysosporium: purification, characterization and catalytic properties of a unique H2O2 requiring oxygenase. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81: 22802284.Wariishi H, Valli K, Gold MH. Manganese () oxidation by manganese peroxidase from the basidiomycetes Phane

37、rochaete chrysosporium. Kinetic mechanism and role of chelators. J Biol Chem, 1992, 267: 2368823695.Marklund S, Marklund C. Involvement of superoxide anion radical in the autooxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem, 1974, 47: 469474.Aebi H. Catalase in

38、vitro. Methods Enzymol, 1984, 105: 121124.Rapoport R, Hanukoglu I, Sklan D. A fluorimetric assay for hydrogen peroxide, suitable for NAD (P)H-dependent superoxide generating redox systems. Anal Biochem, 1994, 218: 309313.Malarczyk E. Transformation of phenolic acid by Nocardia. Acta Microbiol Pol, 1

39、998, 38(1): 4553.Padzioch-Czochra E, Malarczyk J, Sielewiesiuk J. Relationship of demethylatioin processes to veratric acid concentration and cell density in cultures of Rhodococcus erythropolis. Cell Biol Int, 2003, 27: 325336.Draper HH, Squires EJ, Mahmoodi H, et al. A comparative evaluation of th

40、iobarbituric acid methods for the determinatoion of malondialdehyde in biological materials. Free Radic Biol Med, 1993, 15: 353363.Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the priciple of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248254.Goldstein S, Samuni A, Arnovitch Y, et