CF熒光定量PCR儀操作指南(Bio-rad)

1、(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX96CFX96 實時熒光定量 PCR 儀操作流程及留意事項開頭運行儀器翻開電腦翻開定量 PCRCFX Manager放置樣品將 PCR 反響體系參加到 0.2ml 低緣八聯管,蓋上管蓋;或參加低緣 96 孔板,用光學級封膜封好。留意,必需帶一次性塑料手套,不要讓手指接觸到反響管外表。將反響管按挨次放入儀器的加熱孔中.設置程序，運行試驗PCRa。 設置熱循環(huán)程序文件(Protocol Tab b。設置反響板文件(Plate Tab. C.點擊“Start Run”鍵，運行程序熱循環(huán)程序文件Protocol Tab設置指南：點擊 Edit編輯或

2、 Create New創(chuàng)立程序.反響板設置文件Plate Tab設置指南：選擇本次試驗所要使用的熒光染料種類;單擊樣品類型;如要某些反響孔第一熒光染料對應的樣品類型為標準品(Standard,點擊“DilutionSeries”鍵可設置其標準品濃度及稀釋倍數。點擊“Start Runopen lidClose lid關閉熱蓋Start Run，保存文件，開頭運行程序。結果分析PCRCt點擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結果報告單關閉運行儀器試驗完畢后取出反響管，挨次關閉 CFX Manager 軟件、定量 PCR 儀電源，關閉電腦。留意！CFX 儀器上蓋局部為全自動把握，在通電狀態(tài)，嚴禁

3、任何人為干預上蓋開啟或關閉的行為，此類行為會導致上蓋故障，危及儀器使用。(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager試驗操作程序設置圖 1 顯示試驗設置窗口中一個預覽的程序。點擊 CreateNew，翻開程序編輯器創(chuàng)立一個的程序。點擊 SelectExisting，通過掃瞄器加載一個程序或對其進展編輯。使用 Express Load Edit Selected,翻開程序編輯器編輯所選程序的各個步驟。點擊 Start Run開頭運行當前加載的程序。程序編輯器程序編輯器可用來創(chuàng)立一個程序或編輯一個已存在的程序，圖 2。1在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步(該步驟會用

4、藍色高亮顯示)，點擊溫度或保持時間進展直接編輯。 2點擊 Insert Step在程序中增加一個溫度步驟。點擊 Delete Step在程序中刪除選中的步驟.(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)點擊 Add Plate Read to Step,在程序中指定獵取熒光數據的時間。假設當前的高亮顯示步驟已經進展了讀板設置，則這一選項變?yōu)?RemovePlateRead.假設在這一步不想獵取數據，則點擊 RemovePlateRead.點擊 GOTO 步驟的重復次數，轉變程序中的循環(huán)次數，圖 2 第 4 步。點擊 GOTO 步驟數可轉變 GOTO的步驟.增加一個梯度步驟：在程序編輯把握窗

5、口中，點擊 Insert Gradient,圖 2.對梯度中最低和最高溫度值進展編輯,在圖形模式，文本模式下或消滅在文本模式右側的梯度范圍計算器中直接點 擊數值進展編輯，圖 3.在梯度范圍計算器中，對任何一行都可以賜予一個指定的溫度.每行的溫度都會調整為適宜的溫度來滿足指定的溫 度范圍。增加熔解曲線：1在程序編輯把握窗口中，點擊 Insert Melt Curve ，圖 2。2在圖形或文本顯示模式下，點擊溫度值來編輯融解曲線范圍的最低和最高溫度，圖 4 第 5 步。(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)點擊增量值來編輯數據獵取的溫度區(qū)間。點擊保持時間編輯每一個增量溫度的保持時間。(完

6、整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager定量分析數據掃瞄擴增圖表可以顯示試驗中每個循環(huán)每個孔收集的相對熒光信號曲線。點擊位于擴增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要11。選中的孔是藍色的，未選中的孔是亮數據分析選項 CFXManager Settings Threshold 可以轉變基線范圍。軟件會自動計算基線的位置?？梢渣c擊并拖動閥值線來手動定位.點擊工具欄中 View/Edit Plate按鈕來編輯孔的內容，可以臨時創(chuàng)立的分群，從分析中增加或刪掉一些孔。圖表選項可用鼠標右鍵點擊任何圖表來復制或保存圖像，或選擇 Chart Options 來轉變軸范圍或刪除柵格,圖 2.

7、點擊工具欄中 Trace Styles 按鈕，或鼠標右鍵點擊任何圖表來設定制定孔的熒光信號曲線顏色。鼠標左鍵點擊任何圖表,向下(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)和拖動光標可以放大圖表?？椎姆秩簲祿呙槭褂霉ぞ邫谥?Select Well Group 下拉菜單來掃瞄指定孔的分群數據，圖 3.軟件可以針對每個分群作為獨立的試驗來處理,每一個分群可針對自己的設置進展分析，如進展自身標準曲線的分析。定量數據分析顯示選項點擊數據分析窗口中 Quantitation Data，掃瞄數據計算和統(tǒng)計，包括每個孔的閥值 CT 和平均值以及復制的標準偏差，圖 4。點擊任一列的標題進展基于列的行分類。

8、鼠標右鍵點擊電子表格并選擇 Sort 可進展基于多個列的行分類。鼠標左鍵點擊任一列的標題并向左或向右拖動可以重排列電子表格中列的挨次。鼠標右鍵點擊電子 表格,選擇數據輸出格式如 text，XML 或 Excel 輸出數據,圖 4。從 Quantitation Data 下拉菜單中選擇 Plate，在反響板柵格模式下顯示所選熒光的孔數據.創(chuàng)立報告顯示選項點擊數據分析窗口工具欄中 Report 按鈕,圖 1,翻開 Report 窗口，圖 5。點擊報告選項列表中的檢查窗，使制定信息包含5 File并選擇 SavePDF格式保存報告,或選擇Print打印報告.也可以保存報告為其它的文件格式.(完整)C

9、FX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager通過嚴謹的質量把握,您可以使用 Gene Expression Module of CFX Manager 軟件來評估樣品之間靶標濃度的相對差異。這種應用最常用的使用是評估 cDNA 樣品中靶標的濃度來推斷其 mRNA 水平。通常，一個或多個參照基因的含量被用來衡量目標基因的水平。參照基因用來校正上樣的差異或各樣品取樣的差異。通過生物學條件的爭辯，參照基因的表達水平通常不 發(fā)生變化.基因表達分析設置圖 1 顯示各樣品孔含單一的熒光，四個復制類群，包含兩個不同靶標名稱和兩個不同的樣品名稱。指定參照基因點擊反響板編輯器中 Experime

10、nt Settings 或 Gene Expression Module,翻開試驗設置窗口,圖 2.選擇 Targets。3點擊適宜的檢查窗選擇將被使用為參照基因的靶標。點擊 Show Analysis Settings 檢查窗，為靶標設置反響擴增效率。Auto Efficiency 檢查窗被默認設定.假照試驗中運行一個標準曲線，從標準曲線中計算得到的擴增效率將在計算中被使用.或者對適宜的靶標輸入指定反響擴增效率值,則計算中將使用這一擴增效率值。指定比照樣本(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)在 Experiment Settings窗口，選擇 Samples標簽。31，同時全部其

11、他樣本相對于比照樣本的值會被顯示出來.從 Mode4：a.NormalizedExpression Ct-靶標基因的相對量可通過樣本的參照基因來進展相對量的衡量.(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)b。相對量Ct-靶標基因的相對量不能被衡量；結果顯示的是試驗中靶標基因相對于其他樣品的基因濃度.圖形選項Graph Data Graph Data 選項默認是比照相關。X 軸下拉菜單中選擇 X 軸以 Sample 顯示或 TargetY 軸下拉菜單中選擇 Linear,Log2 或 Log10 作為 YScaling Option下拉菜單中選擇 Highest,Lowest 或 Unscaled。Error Type下拉菜單