環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)

1、試驗(yàn)一 一般光學(xué)顯微鏡的使用及其對(duì)微生物一般形態(tài)的觀看一、試驗(yàn)?zāi)康牧私庖话愎鈱W(xué)顯微鏡的構(gòu)造及其各局部的作用。把握一般光學(xué)顯微鏡的正確使用和維護(hù)方法。通過(guò)低倍鏡、高倍鏡觀看藻類、酵母培育液和穎活性污泥中微生物的一般形態(tài)。二、試驗(yàn)原理一般光學(xué)顯微鏡由機(jī)械局部和光學(xué)局部組成。1-1 雙目生物顯微鏡機(jī)械局部：鏡筒：位于鏡臂上端的空心圓筒，是光線的通道。鏡筒的上端可插入目鏡，下面與轉(zhuǎn)換器相連。轉(zhuǎn)換器：位于鏡筒下端，是一個(gè)可以旋轉(zhuǎn)的圓盤(pán)。有34 個(gè)孔，用于安裝不同放大倍數(shù)的物鏡。載物臺(tái)：載物臺(tái)是放置標(biāo)本的方塊平臺(tái)，中心有透光孔，載物臺(tái)上面有玻片夾持器，側(cè)面有移動(dòng)手輪，可縱向和橫向移動(dòng)標(biāo)本。調(diào)焦手輪：包括粗

2、調(diào)手輪和微調(diào)手輪，可使載物臺(tái)上下升降，調(diào)整物鏡和標(biāo)本之間的距離。光學(xué)局部：1目鏡：放在鏡筒上，配有10倍1016倍16兩種。物鏡：裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，有低倍鏡410、高倍鏡4和油鏡10，是顯微鏡中最主要的局部。各種鏡頭上都刻有放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑N A 及所要求蓋玻片厚度等主要參數(shù)。物鏡的性能由數(shù)值孔徑打算，并且還依靠于物鏡的區(qū)分率。聚光器：由聚光鏡和孔徑光闌組成。聚光鏡的作用是把光線聚攏在標(biāo)本上，增加 啟到物鏡出瞳的 7080%時(shí)，就可以得到足夠比照度的良好圖象。假設(shè)開(kāi)得太大，超過(guò)物鏡的數(shù)值孔徑，就會(huì)產(chǎn)生光斑；假設(shè)開(kāi)得太小，則區(qū)分率下降，降低物像的清楚度。電光源：在顯微鏡的下部，供給觀看標(biāo)本時(shí)所

3、用光源。三、試驗(yàn)器材一般光學(xué)顯微鏡雙目生物顯微鏡載玻片、蓋玻片假設(shè)干玻璃棒、滴管濾紙、擦鏡紙?jiān)孱?、酵母培育液，穎活性污泥四、試驗(yàn)方法低倍鏡的操作、10、40、100旋緊在轉(zhuǎn)換器上。2標(biāo)本放在載物臺(tái)上，用玻片夾持器挾緊。并用移動(dòng)手輪移動(dòng)所要觀看的目的物到圓孔的正中心。翻開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)整聚光器，使光路對(duì)準(zhǔn)載物臺(tái)中心的光孔，光亮度要適宜。10 倍物鏡對(duì)準(zhǔn)光孔。用粗調(diào)焦手輪使物鏡與標(biāo)本距離至最小，同時(shí)要側(cè)臉觀看，以免壓壞標(biāo)本玻片或損壞物鏡。調(diào)整瞳距。眼睛接近目鏡觀看，左右手用移動(dòng)手輪輕輕移動(dòng)玻片夾持器，右左手用粗調(diào)焦手輪將載物臺(tái)下移向內(nèi)旋轉(zhuǎn)調(diào)焦手輪，假設(shè)見(jiàn)到目的物，但不是格外清楚，再用細(xì)調(diào)焦手輪調(diào)整，

4、至目的物清楚為止。假設(shè)粗調(diào)焦手輪旋得太快，超過(guò)焦點(diǎn)，必需從第狀況下調(diào)粗調(diào)手輪，防止沒(méi)有把握的旋轉(zhuǎn)使物鏡與載玻片相撞碰壞。注：觀看時(shí)兩眼同時(shí)睜開(kāi)，雙眼不感覺(jué)疲乏。高倍鏡的操作使用高倍鏡前，先用低倍鏡觀看操作方法同低倍鏡的操作。旋動(dòng)轉(zhuǎn)換器，換用高倍鏡40觀看，假設(shè)高倍鏡觸及載玻片應(yīng)馬上停頓旋動(dòng)， 換用高倍鏡時(shí)根本可以看到目的物，假設(shè)模糊，用微調(diào)焦手輪略微調(diào)整一下就清楚可見(jiàn)。微生物形態(tài)觀看液上留意不要有氣泡即成標(biāo)本片，用低倍鏡和高倍鏡觀看。記錄微生物的形態(tài)特征。四、試驗(yàn)記錄及結(jié)果1-1 微生物的形態(tài)觀看記錄項(xiàng)項(xiàng)目放大倍數(shù)低倍鏡觀看高倍鏡觀看五、思考題鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么要先用低倍物鏡觀看？畫(huà)一個(gè)細(xì)胞構(gòu)

5、造的示意圖。試驗(yàn)二 微生物的計(jì)數(shù)酵母菌的顯微鏡直接計(jì)數(shù)一、試驗(yàn)?zāi)康牧私獠盐粘Ｓ玫难蛴?jì)數(shù)板的構(gòu)造。學(xué)會(huì)一般的顯微鏡直接計(jì)數(shù)方法。二、試驗(yàn)原理測(cè)定微生物數(shù)量方法很多，通常承受的有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法。 Petroff Hausser 血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4 3 個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)方格網(wǎng)圖 2-。每個(gè)方格網(wǎng)共分 9 大格，其中間的一大格稱為計(jì)數(shù)室常被用作微生物的計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)室的刻度有兩種：16 25 25 16 有一個(gè)共同特點(diǎn)，即每個(gè)大方格都由400個(gè)小方格組成圖2-

6、。1mm1mm2，每個(gè)小方格的面積為 1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)室底部之間的間隙為 0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室大方格的體積為 0.1mm3。使用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)時(shí)，先要測(cè)定每個(gè)小方格或中方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液或每克樣品中微生物細(xì)胞的數(shù)量。圖2-1血球計(jì)數(shù)扳的構(gòu)造平面圖中間平臺(tái)分為兩半，各刻有一個(gè)方格網(wǎng))圖2-2血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)網(wǎng)的分區(qū)和分格側(cè)面圖中間平臺(tái)與蓋玻片之間有0.1 毫米的間隙三、試驗(yàn)器材1 臺(tái)1 塊穎酵母培育液蓋玻片、擦鏡紙、濾紙四、試驗(yàn)方法取干凈的血球計(jì)數(shù)板一塊。(勿使產(chǎn)生氣泡)。靜置約 5 分鐘，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀看計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)

7、時(shí)用 16 中格的計(jì)數(shù)板，按對(duì)角線方位，取左上、左下、右上、右下的4 個(gè)中格(即100 小格)25 中格計(jì)數(shù)板，除數(shù)上述四格外，還需數(shù)中心1 中格的酵母 菌數(shù)(即 80 小格)。由于菌體在計(jì)數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到， 上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以削減誤差。 5凡酵母菌的芽體到達(dá)母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)分?jǐn)?shù) 2 次，取其平均值，按下述公式計(jì)算出每毫升菌液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)。80小格內(nèi)總數(shù)每毫升菌液含菌數(shù)80稀釋倍數(shù)6血球計(jì)數(shù)板用后，在水龍頭上用水柱沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干。2-1 試驗(yàn)記

8、錄工程各工程各 中 格 菌 數(shù)計(jì)次1212345液總菌數(shù)平 均五、試驗(yàn)結(jié)果及分析按上面的公式求出每毫升菌液總菌數(shù)和平均值，分析產(chǎn)生誤差的緣由。試驗(yàn)三 微生物的大小測(cè)定一、試驗(yàn)?zāi)康募由顜状箢愇⑸飳?shí)際大小的概念把握測(cè)量微生物的大小長(zhǎng)寬的一般技術(shù)二、試驗(yàn)原理, 只能在顯微鏡下來(lái)測(cè)量。用于測(cè)量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。 使用前須用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測(cè)微尺校正，以求得在肯定放大倍數(shù)下實(shí)際測(cè)量時(shí)的每格長(zhǎng) 度。三、試驗(yàn)器材1 臺(tái)1 個(gè)1 個(gè)載玻片、蓋玻片、濾紙酵母、綠藻培育液，穎活性污泥玻璃棒、滴管四、試驗(yàn)方法目鏡測(cè)微尺的校正 1mm 100 0.01mm 10 um。先用低倍鏡觀看，對(duì)

9、準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，然后轉(zhuǎn)換成高倍鏡，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡， 使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)移動(dòng)手輪，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻 尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。由于鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)10 微米，所以由以下公式可以算出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度：3-1 目鏡測(cè)微尺校正記錄項(xiàng) 目項(xiàng) 目實(shí) 驗(yàn) 數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)A鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)(B)目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度 m12平 均目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度BA10 m注：當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必需重校正目鏡測(cè)微尺每一格所代表的長(zhǎng)度。微生物個(gè)體大小的測(cè)量校正好目鏡測(cè)微尺后，取出鏡臺(tái)測(cè)微尺放回盒內(nèi) ，放回原處。此時(shí)不要再任憑變動(dòng)目鏡和物鏡放

10、大倍數(shù)，微生物個(gè)體大小的測(cè)定只能在這特定的狀況下進(jìn)展。鏡進(jìn)展測(cè)量，用目鏡測(cè)微尺測(cè)出微生物長(zhǎng)、寬各占幾格(缺乏一格的局部估量到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù))，測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度，即等于該微生物的大小，記錄，查找3次，求出平均值。3-2 微生物個(gè)體大小測(cè)量記錄單位：m項(xiàng) 目項(xiàng) 目次 數(shù)123平 均五、試驗(yàn)結(jié)果及分析求出所觀看的微生物個(gè)體大小的平均值，爭(zhēng)辯與理論值的誤差緣由。試驗(yàn)四 培育基的制備及滅菌一、試驗(yàn)?zāi)康纳璨Ａ髅蟮南礈旌蜏缇暗念A(yù)備工作。把握培育基的制備方法。把握高壓蒸汽滅菌技術(shù)。二、試驗(yàn)原理 生長(zhǎng)發(fā)育的水分、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)素以及某些特需的微量元素等。此外，培育基還應(yīng)具有

11、適宜的酸堿度(pH 值)和肯定緩沖力量及肯定的氧化復(fù)原電位和適宜的滲透壓。使用目的，可將培育基分為選擇培育基、加富培育基及鑒別培育基等。 固劑而不致引起化學(xué)成份變化9545(25-37)不會(huì)溶化而保持固體狀態(tài)。滅菌是用物理或化學(xué)的方法來(lái)殺死或除去物品上或環(huán)境中的全部微生物學(xué)的方法殺死物體上絕大局部微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒實(shí)際上是局部滅菌。培育基要進(jìn)展嚴(yán)格滅菌，對(duì)工作場(chǎng)所進(jìn)展消毒，以保證工作順當(dāng)進(jìn)展。三、試驗(yàn)器材1培育皿90mm5套2試管15150m5 18180m2 支，試管架3吸量管10m2 1m8 支4錐形瓶250mL3 個(gè)5燒杯500mL1 個(gè)，50mL1 個(gè)吸耳球，

12、玻璃棒，滴管紗布、脫脂棉、報(bào)紙、周密pH 試紙漏斗、漏斗架910% NaOH 溶液、10% HCl 溶液牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水高壓蒸氣滅菌器電熱恒溫培育箱天平、電爐、鑷子、牛角勺四、試驗(yàn)方法 1玻璃器皿的洗滌和包裝洗滌入枯燥箱中烘干，備用。包裝培育皿由一底一蓋組成一套，用包裝紙將5 套培育皿包好。移液管的吸端用細(xì)鐵絲將少許棉花塞入構(gòu)成11.5cm 端，放在 45cm 30 夾角，折疊包裝紙包住移液管折疊打結(jié)。按試驗(yàn)需要，可單只包裝或多只包裝，待滅菌。用棉塞將試管管口和錐形瓶瓶口部塞住 圓型，對(duì)折后卷成卷，一手握粗端，將細(xì)端塞入試管或錐形瓶口內(nèi)，棉塞不宜過(guò)松或過(guò)緊， 用手提棉塞，管

13、、瓶不掉下為準(zhǔn)。棉塞四周應(yīng)緊貼管壁，不能有皺折，以防空氣中的微生物沿棉塞皺折侵入。棉塞插入 2/3，其余留在管口外，便于拔塞。試管、錐形瓶塞好棉塞后， 用包裝紙包好，放在滅菌桶內(nèi)待滅菌。2培育基的配制培育基配方牛肉膏：1g；蛋白胨：2g；氯化鈉：1g；瓊脂：4g；蒸餾水：200mL；pH：7.47.6操作方法500mL 200mL 的蒸餾水。10NaOH 10HCl 調(diào)整pH7.47.6。2 250mL 的錐形瓶中，分別塞上棉塞，包扎好待滅菌。培育基的分裝裝置與棉塞A：培育基的分裝圖 B：棉塞的做法1：正確；2：管內(nèi)太短，外部太長(zhǎng)；3：整個(gè)棉塞太松；4：管內(nèi)太緊，外部太短松3滅菌滅菌的方法：滅

14、菌的方法很多，一般可分為加熱、過(guò)濾、照耀和使用化學(xué)藥品等方法。加熱 簡(jiǎn)潔凝固變性，所以濕熱滅菌效果好。濕熱滅菌的溫度一般是在12115-30 分鐘，而干1602 121的同樣效果。干熱滅菌法1602 50左右，將物品取出。注：滅菌時(shí)溫度不得超過(guò)170，以免包裝紙燒焦。滅菌好的器皿應(yīng)保存好，切勿弄破包裝紙，否則會(huì)染菌。高壓蒸汽滅菌法此法使用高壓蒸汽滅菌器，微生物試驗(yàn)所需的一些器皿、器具、培育基不耐高溫者除外 等都可用此法滅菌。滅菌的操作過(guò)程滅菌器的使用方法。手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作方法：首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)參加適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。

15、留意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效 果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。 3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊 相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊全都，勿使漏氣。 4用電加熱，并同時(shí)翻開(kāi)排氣閥，使水沸騰以排解滅菌器內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡 后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而漸漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)， 把握熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本試驗(yàn)用1.05kg/cm2，121，20 分鐘滅菌。5滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0 時(shí)， 翻開(kāi)0 時(shí)，翻開(kāi)排氣閥，

16、就成棉塞沾染培育基而發(fā)生污染。637下培育 24 小時(shí)，經(jīng)檢查假設(shè)無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。注：每次使用高壓蒸汽滅菌器前，認(rèn)真觀察滅菌器內(nèi)的水位是否適宜。五、思考題培育基依據(jù)什么原理配制成的？根底培育基中不同的成分各起到什么作用？說(shuō)明濕熱滅菌比干熱滅菌的優(yōu)越性。試驗(yàn)五 活性污泥法污水處理過(guò)程中細(xì)菌菌落總數(shù)CFU的測(cè)定一、試驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)菌總數(shù)指標(biāo)的意義。把握稀釋平板法。把握細(xì)菌菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)方法。二、試驗(yàn)原理菌落總數(shù)說(shuō)明有機(jī)物污染程度。活性污泥菌含量細(xì)菌總數(shù) 度及進(jìn)出水的細(xì)菌總數(shù)直接反映了活性污泥活性的好壞和水質(zhì)的變化狀況。在實(shí)際測(cè)定中， 通常用適合大多數(shù)異養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)的養(yǎng)分瓊脂培育基進(jìn)展培育，以24

17、h、37恒溫培育產(chǎn)生的 菌落總數(shù)進(jìn)展計(jì)算。三、試驗(yàn)器材培育皿90mm5 套已滅菌試管15150mm5 支已滅菌、試管架吸量管10m2 1m8 支已滅菌錐形瓶250mL1 個(gè)已滅菌1 瓶已滅菌無(wú)菌水200mL1 瓶7燒杯100mL1 個(gè)酒精燈吸耳球四、試驗(yàn)方法稀釋水樣1 90mL 5 9mL 的無(wú)菌水排列好,10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 依次編號(hào)， 10mL 10 mL 90mL 內(nèi)含玻璃珠中，將移液管吹洗3 次，用手搖10 分鐘將顆粒狀樣品打散。即為10-1 濃度的菌液。1mL 1 mL10-1 9mL 3 10-2 濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10-6。注：視

18、水體污染程度定稀釋倍數(shù)，取在平板上能長(zhǎng)出 30300 個(gè)菌落的水樣稀釋倍數(shù)。接種3 1mL 15 mL 已溶化且冷卻至4左右的養(yǎng)分瓊脂培育基，并馬上旋搖平皿順時(shí)針或逆時(shí)針基充分混勻，冷凝后即成平板，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面朝上，置于37恒溫培育箱培育。 3計(jì)菌落數(shù)24h 的平板取出計(jì)菌落數(shù)。五、菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法菌落總數(shù)，計(jì)算平均值，再乘以稀釋倍數(shù)得出 1mL 水樣中細(xì)菌菌落總數(shù)。各種不同狀況的計(jì)算方法如下：1首先選擇平均菌落數(shù)在 30300 之間者進(jìn)展計(jì)算，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告之表5-1例1。 2假設(shè)有兩個(gè)稀釋度的平均菌落均在 30300 之間，則按兩者之菌落總數(shù)的比值來(lái)打算，假設(shè)22表 5-1例2 及例。3假設(shè)全部稀釋度的