免疫組化技術(shù)簡介課件

1、免疫組化技術(shù)簡介CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點(diǎn)05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點(diǎn)05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制基本概念抗原（Antigen, Ag）一類能刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞等，并能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)或體外特異性結(jié)合的物質(zhì)?？贵w（Antibody, Ab）機(jī)體受抗原刺激后由B淋巴細(xì)胞，特別是漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，稱為免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）?；靖拍羁贵w的結(jié)構(gòu)V區(qū)氨基酸的種類和排列

2、順序千變?nèi)f化，故可形成許多種具有不同結(jié)合抗原特異性的抗體。（抗原特異性，第一抗體）C區(qū)氨基酸的組成和排列在同一種屬動物Ig同型L鏈和同一類H鏈中都比較恒定。制備第二抗體的重要基礎(chǔ)。一抗：鼠抗人二抗：羊抗鼠基本概念單克隆抗體由同一克隆細(xì)胞產(chǎn)生，針對抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。多克隆抗體由不同細(xì)胞產(chǎn)生，其免疫化學(xué)特性不同，能夠識別抗原表面多種抗原決定簇的多種抗體的混合物?；蚬こ炭贵w在基因水平上對Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，甚至是在人工全合成后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的新型抗體。CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點(diǎn)05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制基本

3、原理顯色系統(tǒng)酶免疫組化染色中的常用的酶及顯色底物辣根過氧化物酶/HRP：DAB、AEC堿性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP酶的選擇HRP染色結(jié)果比AP染色結(jié)果保存時(shí)間長含有內(nèi)源性HRP的組織切片：首選標(biāo)記酶為APAP和HRP結(jié)合可進(jìn)行雙重或3重免疫組化標(biāo)記，對比清晰操作流程技術(shù)要點(diǎn)免疫原理的選擇一抗（屬種、單/多抗、濃縮/即用型）二抗（屬種、標(biāo)記方法）顯色方式技術(shù)要點(diǎn)取材組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）；大小（110.5cm）；取病變組織與正常組織交界處；避免對組織標(biāo)本的損傷和擠壓。印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織 (經(jīng)新鮮標(biāo)本最大面積剖開，充分暴露病灶，將載玻片輕輕壓與組

4、織切面，細(xì)胞粘附于玻片上，然后固定）（缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞有重疊）各種體液、穿刺液：可直接涂片（血液、組織液等）或離心后涂片（細(xì)胞少腦脊液、腹水等）。培養(yǎng)細(xì)胞：懸浮細(xì)胞離心后涂片；貼壁細(xì)胞可爬片。取材時(shí)間要早（24小時(shí)以內(nèi)），避免組織自溶，使抗原變性消失或嚴(yán)重彌散。組織切塊厚度不易超過0.5cm，以便固定液的及時(shí)滲透及脫水。技術(shù)要點(diǎn)固定目的：凝固蛋白，終止細(xì)胞內(nèi)酶的作用，防止細(xì)胞自溶；固定細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)；保持組織細(xì)胞的抗原性；防止細(xì)胞層脫落；去除細(xì)胞內(nèi)的脂類（妨礙抗體結(jié)合）；防腐。注意事項(xiàng)：組織塊不宜過大；固定液的量一般以組織塊大小的30倍為宜；必須選擇對組織滲透力強(qiáng)，同時(shí)又不致使組織過

5、度收縮或膨脹的試劑；固定時(shí)間一般以24小時(shí)為宜。固定液的選擇：所有的標(biāo)本固定必須根據(jù)其性質(zhì)及所進(jìn)行的組織化學(xué)反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?。如甲醇、丙酮、甲醛、乙醇等。甲醛固定后，抗原容易被掩蓋，形成醛鍵或羧甲基，使蛋白交聯(lián)封閉部分抗原表位。技術(shù)要點(diǎn)石蠟切片優(yōu)點(diǎn)：對組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保存好，對組織的定位很準(zhǔn)確，是觀察組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法，可以用于回顧性研究。缺點(diǎn)：抗原常被封閉和破壞。對抗原的保存不如冰凍切片。冰凍切片優(yōu)點(diǎn)：能避免石蠟切片因固定，脫水，浸蠟等對抗原的損失，較好的保存組織抗原的免疫活性，適用于不穩(wěn)定的抗原。缺點(diǎn)：不易保存（-80）；細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞抗原結(jié)構(gòu)，造成抗原的彌散使定位不準(zhǔn)確。能

6、做石蠟切片的就能做冰凍切片，能做冰凍切片的不一定能做石蠟切片！技術(shù)要點(diǎn)抗原修復(fù)免疫組化在制片的過程中由于廣泛的蛋白交聯(lián)而使其組織的某些抗原決定簇發(fā)生遮蔽、致使免疫細(xì)胞化學(xué)的信號減弱或消失等不良效應(yīng)。使遮蔽的組織抗原決定簇重新暴露的方法，即抗原修復(fù)?？乖迯?fù)常用方法：酶修復(fù)法（胰蛋白酶、胃蛋白酶和無花果酶）；熱修復(fù)（高壓修復(fù)、微波爐修復(fù)、煮沸法）CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點(diǎn)05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制結(jié)果判讀必須設(shè)立對照陽性組織對照陰性組織對照陰性試劑對照（空白對照；替代對照；吸收試驗(yàn)；抑制試驗(yàn)）自身對照沒有對照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的！結(jié)

7、果判讀陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)由于檢測方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因染色方法靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)，判斷時(shí)應(yīng)注意。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽性表達(dá)，特別是酶免疫標(biāo)記因?yàn)檫@類陽性著色多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。對免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對化應(yīng)結(jié)合臨床資料、X線等影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析。結(jié)果判讀非特異染色免疫組化染色過程中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴(yán)重干擾免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)竭力避免或減輕。原因涉及免疫組化染色流程的各個環(huán)節(jié)，可來自： 內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶、內(nèi)源性生物素等)；試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應(yīng)，F(xiàn)c受體干擾等)

8、；組織處理不當(dāng)(組織固定不及時(shí)或固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位、洗滌不充分所導(dǎo)致的游離試劑殘留等)。特異性染色非特異性染色分布在特定的部位, 具結(jié)構(gòu)性無分布規(guī)律，常出現(xiàn)在切片邊緣、刀痕或皺折部位及壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)域 由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，所以顯色不均一不限于單個細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，均勻顯色陽性與陰性細(xì)胞相互交雜，同一切片上顯色強(qiáng)度不一細(xì)胞和周圍的結(jié)締組織均無區(qū)別的著色CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點(diǎn)05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制失敗原因假陰性常見原因失敗原因假陽性常見原因質(zhì)量控制試劑的質(zhì)量控制抗體特異性、敏感性測試 ，抗體最佳稀釋度的選擇 ，稀釋劑 ，抗體孵育溫度、時(shí)間。儀器的質(zhì)量控