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文檔簡介
1、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜缺氧誘導(dǎo)因子【關(guān)鍵詞】STZ大鼠;,糖尿病視網(wǎng)膜病變;,缺氧誘導(dǎo)因子;,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子Expressinsfhypxiainduiblefatr1andvasularendthelialgrthfatrinretinafstreptztinindueddiabetirats【Abstrat】AI:Tstudytheexpressinsfhypxiainduiblefatr1(HIF1)andvasularendthelialgrthfatr(VEGF)inretinafstreptztinindueddiabetirats.ETHDS:Sixtyisterratsered
2、ividedinttestinggrup(grupT,45ases)andntrlgrup(grup,15ases).StreptztinindueddiabetianialdelsereadeingrupT,andthentheratseredividedint3grups(T1,T3,T5)ardingtthetie(1,3,5nths)afterdeling.Theratsingruperealsdividedint3grups(1,3,5).TheexpressinfVEGFasassessedbyiunhistheialethdandtheexpressinfHIF1asassess
3、edbyesternBltting.Alltheresultserequantitativelyanalyzedbytransfredintaverageptialdensity.RESULTS:86.67%-93.33%falltheanialdelseresuessful.ResultsfVEGF:Thereerensignifiantdiffereneinthe3ntrlgrups,asellasbeteengrupT1andntrlgrups(P0.05);ButthesignifiantdiffereneasfundbeteengrupT3,T5(t=6.12,P0.01)andnt
4、rlgrups(t=8.63,P0.01)asellasbeteengrupT3andT5(t=3.45,P0.05).ResultsfHIF1:Thereasnsignifiantdiffereneinthe3ntrlgrupsandinthe3testinggrups(P0.05).ButthesignifiantdiffereneserefundbeteengrupT1,T3,T5andthe3ntrlgrups(t=4.35,5.01,5.34,P0.01).NLUSIN:ebservedtheinreasedexpressinfVEGFandHIF1inretinafstreptzt
5、inindueddiabetirats,andthelatterurredearlierthanthefrer.ItsuggeststhattheinreasedexpressinfHIF1ightbetheinitialfatrfrexpressinfVEGFduringdiabetiretinpathy.【Keyrds】streptztinindueddiabetirats;diabetiretinpathy;hypxiainduiblefatr;vasularendthelialgrthfatr【摘要】目的:討論鏈脲佐菌素STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中缺氧誘導(dǎo)因子1HIF1和血管內(nèi)皮生長因
6、子VEGF的表達(dá)規(guī)律.方法:ister大鼠60只,分為實(shí)驗(yàn)組(T組,45只和對照組(組,15只.實(shí)驗(yàn)組建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,并隨機(jī)分為T1,T3,T5三個(gè)組,每組15只,分別代表糖尿病模型1,3,5;對照組同樣隨機(jī)分為1,3,5三個(gè)組,每組5只.分別采用免疫組織化學(xué)法檢測視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)、免疫印跡法檢測視網(wǎng)膜HIF1表達(dá),結(jié)果以平均吸光度值進(jìn)展定量比擬.結(jié)果:糖尿病模型成功率86.6793.33%.VEGF檢測結(jié)果:對照組各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05;T1與對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05,但T3,T5與對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義t值分別為6.12,8.67,P0.01,并且
7、T3,T5兩組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義t=3.45,P0.05.HIF1檢測結(jié)果:對照組各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05;T1,T3,T5分別與對照組相比,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義t值分別為4.35,5.01,5.34,P0.01,但實(shí)驗(yàn)組各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05.結(jié)論:STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)可觀察到VEGF和HIF1的高表達(dá),后者早于前者,提示在視網(wǎng)膜病變時(shí)HIF1的表達(dá)可能是VEGF表達(dá)的始動(dòng)因素.【關(guān)鍵詞】STZ大鼠;糖尿病視網(wǎng)膜病變;缺氧誘導(dǎo)因子;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子0引言糖尿病目前已成為嚴(yán)重危害公共安康的問題,可引起全身多數(shù)器官并發(fā)癥,而其中微血管并發(fā)癥之一的視網(wǎng)膜病變diabet
8、iretinpathy,DR,也日益成為致盲的主要原因.有關(guān)DR的病理生理過程已有大量實(shí)驗(yàn)研究,并已發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子vasularendthelialgrthfatr,VEGF是引起DR血管滲漏、新生血管形成的主要細(xì)胞因素之一1.然而,在糖尿病患者眼部微環(huán)境下引起VEGF等細(xì)胞因子大量分泌確實(shí)切機(jī)制還不甚明了.本實(shí)驗(yàn)我們從缺氧誘導(dǎo)因子1hypxiainduiblefatr1,HIF1這一途徑,討論糖尿病條件下視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)增加的機(jī)制.1材料和方法1.1材料選取封閉群雄性istar大鼠60只,體質(zhì)量190210g,適應(yīng)性飼養(yǎng)3d,分為實(shí)驗(yàn)組T組,45只和對照組組,15只.將T組再隨機(jī)分為
9、T1,T3,T5三個(gè)組,每組15只,分別代表糖尿病模型1,3,5;組同樣隨機(jī)分為1,3,5三個(gè)組,每組5只.所有動(dòng)物均在一樣條件下飼養(yǎng).鏈脲佐菌素streptztin,STZ),美國Siga公司產(chǎn)品;一抗為兔抗鼠VEGFAb1100,二抗為生物素化羊抗兔IgG,所有抗體和SAB試劑盒,DAB顯色劑均購于美國DAK公司;一抗1200兔抗HIF1多克隆抗體),美國Siga公司.1.2方法1.2.1糖尿病大鼠模型的建立2取STZ溶于0.05l/L檸檬酸緩沖液(pH4.5),配置成濃度1.25%的溶液,按60g/kg對T組大鼠行一次性腹腔內(nèi)注射,組大鼠腹腔注射等量檸檬酸緩沖液.藥物注射后2448h檢測
10、血糖和尿糖,血糖濃度高于16.5l/L,尿糖達(dá),尿量、飲水明顯增多即為模型建立成功;低于上述標(biāo)準(zhǔn)那么為造模失敗.實(shí)驗(yàn)組T1,T3,T5及對照組1,3,5分別在造模成功后1,3,5處死,取標(biāo)本進(jìn)展以下實(shí)驗(yàn).1.2.2免疫組織化學(xué)法SAB檢測視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)10g/L戊巴比妥鈉40L/kg腹腔麻醉,用0.1/L含有40g/L多聚甲醛的PBS液灌流固定,摘除眼球,石蠟包埋后行16連續(xù)切片,SAB法行免疫組織化學(xué)染色檢查,其中對照組一抗以PBS液代替,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)展.陽性結(jié)果為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒.染色結(jié)果用LuzexF實(shí)時(shí)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)展分析,計(jì)算平均A值.1.2.3
11、免疫印跡法esternBlt檢測視網(wǎng)膜HIF1的表達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同前麻醉,固定后,摘除眼球去除眼前段成眼杯,仔細(xì)別離出視網(wǎng)膜組織,剪碎后置于裂解液中機(jī)械勻漿,4,17000g離心30in,取上清液以紫外分光光度計(jì)定量,等量蛋白上樣進(jìn)展75g/LSDSPAGE電泳,電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上.37孵育2h,洗膜,加11000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37孵育1h,洗膜后參加化學(xué)發(fā)光液反響1in,曝光顯影后沖洗膠片.顯色結(jié)果同樣用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均A值.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)展分析處理,結(jié)果以xs表示,采用Fisher確切概率計(jì)算法、多組間比擬方差分析、組間比擬t檢驗(yàn)
12、等進(jìn)展差異顯著性分析.2結(jié)果2.1大鼠糖尿病模型實(shí)驗(yàn)組腹腔注射STZ后成功復(fù)制出糖尿病動(dòng)物模型:T1組15例,成功14例,失敗1例;T3組15例,成功13例,失敗2例;T5組15例,成功14例,失敗1例.通過Fisher確切概率計(jì)算法PT1:3,PT3:5,PT1:5的概率分別為0.388,0.388,0.517,可見三組之間的造模成功率無顯著差異,故可以認(rèn)為三組的造模成功率根本一致.2.2各組不同時(shí)段視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示,對照組各組視網(wǎng)膜VEGF可見弱表達(dá),一般在內(nèi)核層可見少數(shù)陽性染色,但不隨時(shí)間變化而改變圖1.各組不同時(shí)段之間的VEGFA值并無顯著性差異表1.實(shí)驗(yàn)組在成模
13、后1,VEGF表達(dá)較對照組僅略有增強(qiáng),其A值與對照組相比并無顯著性差異,但隨著時(shí)間的延長,實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng),特別是T5組,視網(wǎng)膜內(nèi)核層、節(jié)細(xì)胞層及血管壁等均可見陽性染色圖2.表1各組不同時(shí)段VEGF及HIF1A值略2.3各組不同時(shí)段視網(wǎng)膜HIF1表達(dá)通過免疫印跡檢測,對照組各組HIF1有弱表達(dá),其A值維持一基線狀態(tài),不同時(shí)段差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表1.實(shí)驗(yàn)組各組HIF1表達(dá)均明顯增強(qiáng),與對照組相比有顯著性差異,但各組A值并不隨時(shí)間改變而發(fā)生顯著變化,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表1.圖3顯示成模5后實(shí)驗(yàn)組與對照組HIF1免疫印跡結(jié)果為標(biāo)記物,上下兩個(gè)條帶分別代表225bp和162bp.3討論STZ
14、大鼠是目前比擬公認(rèn)的經(jīng)典糖尿病DR模型,根本可以模擬人背景型DR的大致病理改變2.本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制出STZ大鼠模型,成功率在90%左右,保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可信.糖尿病DR是糖尿病微血管病變在眼底獨(dú)特環(huán)境中的表現(xiàn),其中VEGF起著舉足輕重的作用.VEGF導(dǎo)致新生血管的原因,一方面是直接促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生,另一方面是VEGF使微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強(qiáng),大分子物質(zhì)如纖維蛋白原等進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)中形成纖維蛋白凝膠,允許并支持新生血管和基內(nèi)幕胞向內(nèi)生長3.臨床研究也發(fā)現(xiàn),在合并活動(dòng)性新生血管病變的眼如糖尿病性DR、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、早產(chǎn)兒DR等的眼內(nèi)液中VEGF表達(dá)顯著增高,而在無新生血管對照眼
15、的眼內(nèi)液中那么表達(dá)較低.眼內(nèi)直接給予VEGF更能誘發(fā)出典型的新生血管病變4.本實(shí)驗(yàn)在成模后3和5大鼠視網(wǎng)膜上觀察到了明顯的VEGF高表達(dá),并且有隨時(shí)間延長表達(dá)逐漸增多的趨勢,與對照組相比有顯著性差異,而1組那么沒有明顯增多,提示VEGF是在缺氧發(fā)生后,某些始動(dòng)因素的刺激下表達(dá)增多,符合糖尿病DR的開展規(guī)律.為明確DR時(shí)引起VEGF表達(dá)增多的原因,本實(shí)驗(yàn)還觀察了缺氧誘導(dǎo)因子1HIF1的變化.HIF1是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的核蛋白,它作為轉(zhuǎn)錄因子與靶基因結(jié)合,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,從而使機(jī)體產(chǎn)生一系列缺氧適應(yīng)反響.HIF1是一種異源二聚體,由HIF1和HIF1兩個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成,HIF1亞基主要起構(gòu)造性的作
16、用,在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá);HIF1那么是主要的功能亞基,受缺氧信號的調(diào)控,并且只有在缺氧狀態(tài)下才能穩(wěn)定表達(dá).HIF1的活性主要由HIF1的蛋白質(zhì)程度和活性決定5.能被HIF1誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子內(nèi)有一個(gè)小于100bp的DNA序列,稱為缺氧反響元件hypxiarespnseeleent,HRE,介導(dǎo)細(xì)胞對缺氧的反響,HRE由HIF1結(jié)合位點(diǎn)和兩側(cè)的功能序列構(gòu)成.缺氧條件下HIF1和HIF1蛋白由胞漿進(jìn)入核內(nèi),發(fā)生二聚形成穩(wěn)定的HIF1,活化的HIF1與靶基因HRE中的HIF1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,引起一系列細(xì)胞對缺氧的反響6.而VEGF正屬于上述靶基因之列,其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上
17、游具有HRE構(gòu)造,缺氧狀態(tài)下可被HIF1激活而表達(dá)增多7.本研究發(fā)現(xiàn),造模成功后1,即可見到HIF1的表達(dá)增多,與對照組有顯著性差異,提示此時(shí)視網(wǎng)膜已經(jīng)發(fā)生缺氧性改變.但是其后一段時(shí)間內(nèi),雖然HIF1都保持高表達(dá),但是不同時(shí)段之間卻并無顯著性差異,即HIF1似乎并無隨時(shí)間延長不斷增多的趨勢,這可能與HIF1的半衰期短有關(guān).Huang等8發(fā)現(xiàn):由于HIF1經(jīng)泛素蛋白酶途徑不斷發(fā)生水解,使其在常氧下的半衰期小于1in,因此它很難在細(xì)胞內(nèi)大量聚集,只能在受到缺氧信號刺激后不斷產(chǎn)生,假如缺氧狀態(tài)持續(xù)存在,那么它的表達(dá)就持續(xù)增高,不過不能像VEGF那樣表現(xiàn)出隨時(shí)間不斷增高的趨勢.由于實(shí)驗(yàn)中對VEGF的檢
18、測采用的是免疫組化的方法,受敏感性的限制,在成模后1時(shí),尚不能發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,按照實(shí)驗(yàn)中HIF1的變化規(guī)律,推測此時(shí)VEGF表達(dá)也應(yīng)有一定程度的增多,這有待今后加以探究.【參考文獻(xiàn)】1ShenY,Lai,GrahaE,etal.LngterglbalretinalirvasularhangesinatransgenivasularendthelialgrthfatrusedelJ.Diabetlgia,2022,49(7):1690-1701.2宋鄂,董宇,石博,等.STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型的評價(jià)J.眼科研究,2022,24(2):124-127.3FerraraN,DavisSythT.ThebilgyfvasularendthelialgrthfatrJ.EndrRev,1997,18(1):4-25.4Suganthalaks
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