手足口病標(biāo)本采集及檢測技術(shù)方案

1、 手足口病標(biāo)本采集及檢測技術(shù)方案一、采集標(biāo)本的種類、保存和運輸（一）糞便標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測。糞便標(biāo)本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽，4暫存12小時內(nèi)送達(dá)實驗室，-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于-70冰箱。（二）咽拭子標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯

2、一識別號碼的標(biāo)簽。4暫存并在12小時內(nèi)送達(dá)實驗室，-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于-70冰箱。（三）血清標(biāo)本。各?。▍^(qū)、市）在手足口病流行年份中均應(yīng)采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復(fù)期（發(fā)病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態(tài)變化，評價血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。將血清置于-20以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液。在手足口病的實驗室診斷中，

3、從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時采集多個皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。所采集標(biāo)本4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（五）肛拭子標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標(biāo)本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后，迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（含5%

4、牛血清細(xì)胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。（六）尸檢標(biāo)本。采集腦、肺和腸淋巴結(jié)等重要組織標(biāo)本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應(yīng)多部位取材，每部位應(yīng)取2-3份約5-10g的組織，淋巴結(jié)2個，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。（七）腦脊液標(biāo)本。出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離或核酸檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實

5、驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于70冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。臨床標(biāo)本在運輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融。標(biāo)本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內(nèi)送達(dá)實驗室。依照人間傳染的病原微生物名錄，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標(biāo)本按B類包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運輸，盡量縮短運輸時間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運輸方式，但在運輸過程中應(yīng)采取保護措施，避免強烈震動、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級CDC實驗室時，包裝盒內(nèi)應(yīng)帶冰且包裝完整。在上送標(biāo)本的同時，需附帶相關(guān)的手足口病病例臨床標(biāo)本采樣登記表。二、標(biāo)本采集注意事項在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹

6、液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在標(biāo)本保存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學(xué)診斷的標(biāo)本采集與病毒分離標(biāo)本的采集方法一樣。為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病兩周后采集。標(biāo)本保存液的配置見下表：保存液Eagles液（MEM）80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaHCO3溶液3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）10ml三、實驗室檢測操作流程（一）病毒分離。1.試劑配置（1）細(xì)

7、胞的生長液、維持液的配制見下表：生長液（GM）維持液（MM）Eagles液（MEM）86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml（2）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理液完全PBS液中加入PS溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100g/ ml。完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。A液：試劑品名加入量NACL8.00gKCL0.20gNa2HPO4（無水）0.91gKH2PO40.12g用600800

8、ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。B液：試劑品名加入量MgCl2.6H2O0.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。C液： 試劑品名加入量CaCl20.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。2病毒分離細(xì)胞系許多細(xì)胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長。對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標(biāo)本均需接種到以下兩種細(xì)胞系：RD細(xì)胞，來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。HEp-2細(xì)胞，來源于

9、人喉癌上皮細(xì)胞。3標(biāo)本的處理（1）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理操作步驟：1）在離心管上標(biāo)記標(biāo)本號；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確保離心管上的標(biāo)號與原始標(biāo)本的標(biāo)號一致）；肛拭子為2ml；4）剩余的原始標(biāo)本最好留在原容器中，凍存于20；5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；7）在生物安全柜中將每1份標(biāo)本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應(yīng)再用氯仿處理1次）；8） 1管糞便懸液凍存

10、于20作為備份，另1管存于4-8以備接種。（2）皰疹液標(biāo)本的處理皰疹液標(biāo)本通常直接用于RNA提取或病毒分離。（3）腦脊液標(biāo)本的處理腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標(biāo)本的處理咽拭子要在標(biāo)本運輸（保存）液中充分?jǐn)噭樱ㄖ辽?0下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過濾除菌。4接種和觀察（病毒分離）（1）通常使用ml的斜面試管培養(yǎng)細(xì)胞，傳細(xì)胞時，每管加細(xì)胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以

11、確保細(xì)胞是健康、無污染的。一個健康的單層細(xì)胞會在傳代后48小時左右形成；（2）倒掉生長液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標(biāo)本需要同時接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對照；（5）每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度要求36。（或者使用吸附的方法接種病毒：接種標(biāo)本前，倒掉生長液（GM），每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度為36；吸附1小時后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標(biāo)本需同時接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞。（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培

12、養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（如細(xì)胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+， Ct值35.0的樣本為臨界值。Ct值38.0的樣本或無數(shù)值的標(biāo)本為陰性。（2） One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）雙通道可以同時檢測EV71和CVA16核酸，在提取核酸后短時間（2.5小時）內(nèi)檢測到標(biāo)本中是否含EV71或CVA16核酸。反應(yīng)體系配置反應(yīng)體系共25l，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用

13、5l模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應(yīng)體系及條件隨之變化。a.先將試劑解凍，從試劑盒中取出相應(yīng)的試劑，反應(yīng)液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置25l反應(yīng)體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應(yīng)體系配置如下表： b.將下述反應(yīng)液混勻離心后，按照每管20L分裝于適用的PCR管中。試劑組成1份樣品的量熒光RT-PCR反應(yīng)液12.5l逆轉(zhuǎn)錄酶0.5lTaq酶0.5l引物和探針3lH2O 3.5lc.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應(yīng)管中，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足?？偡磻?yīng)體積25L。熒光R

14、T-PCR循環(huán)條件設(shè)置程序循環(huán)數(shù)溫度（攝氏度）反應(yīng)時間114230 min21952 min3409510 s6035 s60時收集熒光信號結(jié)果分析條件設(shè)定和結(jié)果判斷陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標(biāo)本。陽性對照：提取好的陽性核酸作為模板RNA。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。Ct值35.0的樣本為陽性。Ct值無數(shù)值的標(biāo)本和Ct值38.0的樣本為陰性樣本。38.0 Ct值35.0的樣本為臨界值。注：熒光PCR同時讀取FAM和HEX，進(jìn)行雙通道檢測，F(xiàn)AM熒光Ct值為CVA16的結(jié)果，HEX熒光 Ct值為EV71的結(jié)果

15、。四、生物安全根據(jù)2006年1月11日衛(wèi)健委制定的人間傳染的病原微生物名錄，柯薩奇病毒、?？刹《尽V71型和目前分類未定的其他腸道病毒均屬于危害程度第三類的病原微生物。因此在保證安全的前提下，對臨床和現(xiàn)場的未知樣本檢測操作可在生物安全I(xiàn)I級或以上防護級別的實驗室進(jìn)行，涉及病毒分離培養(yǎng)的操作，應(yīng)加強個體防護和環(huán)境保護。操作糞便、腦脊液和血液等臨床標(biāo)本時要特別注意生物安全，要在II級生物安全柜中進(jìn)行標(biāo)本處理、病毒分離和病毒鑒定，無脊灰疫苗免疫史的人員要進(jìn)行脊灰疫苗免疫。滅活后的血清抗體檢測與PCR檢測可在生物安全I(xiàn)級實驗室進(jìn)行。所有操作應(yīng)遵守國家相關(guān)法律法規(guī)。附表：1手足口病病例臨床標(biāo)本采樣登記

16、表2手足口病病例臨床標(biāo)本檢測結(jié)果登記表附表1 手足口病病例臨床標(biāo)本采樣登記表采樣單位: 填表人： 填報日期： ： 編號Lab ID姓名性別年齡現(xiàn)住址發(fā)病日期臨床診斷標(biāo)本類型采樣日期輕型重型便咽拭子皰疹液血尸檢標(biāo)本其他附表2 省手足口病病例臨床標(biāo)本檢測結(jié)果登記表報告單位: 填表人： 填報日期： ： 編號Lab ID姓名性別年齡現(xiàn)住址發(fā)病日期臨床診斷標(biāo)本類型采樣日期檢測日期實驗結(jié)果RT-PCRRealtime-RT-PCR病毒分離輕型重型便咽拭子皰疹液血尸檢標(biāo)本其它HEV 71CVA 16其他HEVHEV 71CVA 16其他HEVRDHEp-2注釋：1. 凡是檢測的標(biāo)本不論結(jié)果是否陽性均應(yīng)填寫本

17、表；表中每一項內(nèi)容均要填寫完整；2. 如同一病例采集2份級以上標(biāo)本時，每一份標(biāo)本填寫一行，檢測結(jié)果為陰性的標(biāo)本也要上報。 手足口病標(biāo)本采集及檢測技術(shù)方案一、采集標(biāo)本的種類、保存和運輸（一）糞便標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測。糞便標(biāo)本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽，4暫存12小時內(nèi)送達(dá)實驗室，-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于-70冰箱。（二）咽拭子標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液

18、或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。4暫存并在12小時內(nèi)送達(dá)實驗室，-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于-70冰箱。（三）血清標(biāo)本。各?。▍^(qū)、市）在手足口病流行年份中均應(yīng)采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復(fù)期（發(fā)病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態(tài)變化，評價血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血

19、清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。將血清置于-20以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液。在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時采集多個皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。所采集標(biāo)本4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（五）肛拭子標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標(biāo)本，用于

20、病原檢測。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后，迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（含5%牛血清細(xì)胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。（六）尸檢標(biāo)本。采集腦、肺和腸淋巴結(jié)等重要組織標(biāo)本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應(yīng)多部位取材，每部位應(yīng)取2-3份約5-10g的組織，淋巴結(jié)2個，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。（七）腦脊液標(biāo)本。出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離或核酸檢測。采集時間

21、為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于70冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。臨床標(biāo)本在運輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融。標(biāo)本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內(nèi)送達(dá)實驗室。依照人間傳染的病原微生物名錄，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標(biāo)本按B類包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運輸，盡量縮短運輸時間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運輸方式，但在運輸過程中應(yīng)采取保護措施，避免強烈震動、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級CDC實驗室時，包裝盒內(nèi)應(yīng)帶冰且包裝

22、完整。在上送標(biāo)本的同時，需附帶相關(guān)的手足口病病例臨床標(biāo)本采樣登記表。二、標(biāo)本采集注意事項在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在標(biāo)本保存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學(xué)診斷的標(biāo)本采集與病毒分離標(biāo)本的采集方法一樣。為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病兩周后采集。標(biāo)本保存液的配置見下表：保存液Eagles液（MEM）80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaH

23、CO3溶液3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）10ml三、實驗室檢測操作流程（一）病毒分離。1.試劑配置（1）細(xì)胞的生長液、維持液的配制見下表：生長液（GM）維持液（MM）Eagles液（MEM）86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml（2）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理液完全PBS液中加入PS溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100g/ ml。完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。A

24、液：試劑品名加入量NACL8.00gKCL0.20gNa2HPO4（無水）0.91gKH2PO40.12g用600800ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。B液：試劑品名加入量MgCl2.6H2O0.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。C液： 試劑品名加入量CaCl20.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。2病毒分離細(xì)胞系許多細(xì)胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長。對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含E

25、V71、CVA16等腸道病毒感染的標(biāo)本均需接種到以下兩種細(xì)胞系：RD細(xì)胞，來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。HEp-2細(xì)胞，來源于人喉癌上皮細(xì)胞。3標(biāo)本的處理（1）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理操作步驟：1）在離心管上標(biāo)記標(biāo)本號；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確保離心管上的標(biāo)號與原始標(biāo)本的標(biāo)號一致）；肛拭子為2ml；4）剩余的原始標(biāo)本最好留在原容器中，凍存于20；5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；7）在生物安全

26、柜中將每1份標(biāo)本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應(yīng)再用氯仿處理1次）；8） 1管糞便懸液凍存于20作為備份，另1管存于4-8以備接種。（2）皰疹液標(biāo)本的處理皰疹液標(biāo)本通常直接用于RNA提取或病毒分離。（3）腦脊液標(biāo)本的處理腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標(biāo)本的處理咽拭子要在標(biāo)本運輸（保存）液中充分?jǐn)噭樱ㄖ辽?0下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過濾除菌。4接

27、種和觀察（病毒分離）（1）通常使用ml的斜面試管培養(yǎng)細(xì)胞，傳細(xì)胞時，每管加細(xì)胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康、無污染的。一個健康的單層細(xì)胞會在傳代后48小時左右形成；（2）倒掉生長液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標(biāo)本需要同時接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對照；（5）每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度要求36。（或者使用吸附的方法接種病毒：接種標(biāo)本前，倒掉生長液（GM），每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度為36；吸附1小時后，換

28、上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標(biāo)本需同時接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞。（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（如細(xì)胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+， Ct值35.0的樣本為臨界值。Ct值38.0的樣本或無數(shù)值的標(biāo)本為陰性。（2） One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）雙通道可以同時檢測EV71和CVA16核酸，在提取核酸后短時間（2.5小時）內(nèi)

29、檢測到標(biāo)本中是否含EV71或CVA16核酸。反應(yīng)體系配置反應(yīng)體系共25l，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5l模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應(yīng)體系及條件隨之變化。a.先將試劑解凍，從試劑盒中取出相應(yīng)的試劑，反應(yīng)液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置25l反應(yīng)體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應(yīng)體系配置如下表： b.將下述反應(yīng)液混勻離心后，按照每管20L分裝于適用的PCR管中。試劑組成1份樣品的量熒光RT-PCR反應(yīng)液12.5l逆轉(zhuǎn)錄酶0.5lTaq酶0.5l引物和探針3lH2O 3.5lc.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應(yīng)管中，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足。