β細辛醚對谷氨酸所致PC12細胞損傷的愛惜作用

1、- 細辛醚對谷氨酸所致 PC12細胞損傷的愛惜作用陳奕芝 , 方永奇 , 梁 毅, 王綺雯 , 何玉萍【摘要】 目的 研究 - 細辛醚對谷氨酸所誘導的 PC12細胞損傷的愛惜作用 , 并探討其作用機理。方式 用谷氨酸造成 PC12細胞損傷模型, 觀看 - 細辛醚對其細胞形態(tài)、損傷程度、存活力、鈣離子濃度和細胞凋亡的阻礙。結(jié)果 10 mmol/L 谷氨酸作用 PC12細胞 16 h, 顯現(xiàn)明顯損傷 , 凋亡率和死亡率升高 , 培育上清液中 LDH含量增加；、1 五、30g/mL- 細辛醚可有效改善谷氨酸損傷引發(fā)的 PC12 細胞形態(tài)改變 , 提高細胞存活力 , 減少乳酸脫氫酶滲漏； 1 五、30

2、 g/mL - 細辛醚能明顯降低谷氨酸引發(fā)的 PC12 細胞內(nèi)鈣離子濃度和細胞凋亡率。結(jié)論- 細辛醚對谷氨酸所致 PC12 細胞損傷具有愛惜作用 , 其作用機制可能與鈣拮抗作用有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】 PC12 細胞；谷氨酸；鈣； - 細辛醚Abstract ：ObjectiveTo study the protectiveeffectsof-asarone on PC12cellsdamageinduced by Glutamate.Method Theeffectsof -asaroneonPC12cellsafterGlutamateintoxication on morphology, ext

3、ent of damage, livability, intracellular calcium concentration and apoptosis ratio wereobserved.ResultMorphologicalchanges,LDH leakageandintracellular calcium concentration increasing, and cell survival decreasing were observed in PC12 cells exposured toGlutamate., 15, 30g/mL-asaronecan increasecell

4、survival,decrease LDH leakage. intracellular calcium15,30 g/mLconcentration -asarone can and apoptosisreduceratio.Conclusion -asarone prevents the toxicity of Glutamate, and it maybe attribute to its effect of anticalcium.Key words ：PC12 cells ；Glutamate ；Ca2+； -asarone本實驗采納體外培育PC12 細胞方式 , 用谷氨酸 (Glu

5、) 造成損傷模型 , 觀看 - 細辛醚對PC12 細胞形態(tài)學、細胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)活性、細胞內(nèi)游離鈣和細胞凋亡率的阻礙。實驗材料細胞、藥物和試劑高分化 PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。Glu為 Amresco 產(chǎn)品；高糖 DMEM粉劑培育基、胎牛血清、馬血清、 %胰酶均為 GIBCO產(chǎn)品；噻唑藍 (MTT)為 Sigma公司產(chǎn)品；磷酸緩沖液 (PBS)、二甲基亞砜 (DMSO)為北京鼎國產(chǎn)品； Annexin v-FITC 試劑盒購自晶美生物工程； Fluo-3/AM 為 Biotium Inc 產(chǎn)品；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 細胞培育板為 CORNIN

6、G產(chǎn)品。- 細辛醚的制備由本中心完成 , 純度 %。臨用前稱取適量 - 細辛醚與吐溫 -80 及甘油 , 以 111 充分混勻后加滅菌雙蒸水配成終濃度為10 mg/mL- 細辛醚溶液 ,歷時培育基稀釋至所需終濃度。要緊儀器設(shè)備CO2 培育箱 (NUAIK)；倒置相差顯微鏡 (OLYMPUS)； BIO-RAD550型酶標儀； ALTRAEPICS流式細胞儀 (BECKMANCOULTER)；6010 紫外可見分光光度計 ( 惠普上海分析儀器 ) 。實驗方式造模蘇醒后的 PC12細胞接種于 25 cm2 培育瓶中 , 培育液為含 5% 馬血清、 5%胎牛血清的 DMEM高糖培育基 ,37 、 5

7、% C02培育箱中培育。待細胞長滿單層 ,%胰酶消化 , 用含血清的 DMEM培育基終止消化并調(diào)細胞密度為 5104 個/mL, 接種在 96 孔培育板 ( 棄去周圍邊孔 ), 每孔 100 L, 周圍邊孔每孔加入等體積 PBS溶液 , 待細胞貼壁生長交叉成網(wǎng)后用于實驗。實驗分為正常對照組、 Glu mmol/L) 損傷組 , 繼續(xù)培育 16 h 后觀看細胞形態(tài)改變 , 并用 MTT法檢測細胞活力。藥物愛惜實驗PC12細胞接種于 96 孔( 每孔 100 L) 及 24 孔培育板 ( 每孔 1 mL), 培育條件同上 , 待細胞鋪滿單層 , 吸棄原培育基 , 用 PBS液洗 1 次,隨機分為

8、6 組。正常對照組和 Glu 損傷組加入無血清培育基 , 陽性對照組加入終濃度為 10 mol/L 尼莫地平 , - 細辛醚設(shè) 3 個劑量組 , 別離為、 1 五、30 g/mL, 培育 4 h 后, 除正常對照組外 , 其余各組蕩洗后加入終濃度為 10 mmol/L 的 Glu 繼續(xù)培育 16 h, 用于各指標檢測。觀看指標細胞形態(tài)學觀看、存活力(MTT 法) 、培育上清液LDH活性 ( 比色法) 、凋亡率和胞內(nèi)鈣離子濃度 ( 流式細胞儀熒光染色法 ) 。統(tǒng)計學方式數(shù)據(jù)以 xs 表示 , 采納 SPSS 軟件包分析 , 組間比較采納單因素方差分析。3 結(jié)果谷氨酸對 PC12細胞的損傷作用PC

9、12細胞培育 2 h 后完全貼壁 , 呈神經(jīng)細胞樣形態(tài) , 圓形 , 折光性較強 , 生長速度快 ,2 d后生長成網(wǎng)狀。 PC12細胞經(jīng)不同濃度Glu作用 16 h 后, mmol/L Glu 對 PC12細胞形態(tài)學和細胞活力沒有明顯轉(zhuǎn)變 , 而 mmol/L Glu 那么對 PC12細胞有不同程度的損傷 , 表現(xiàn)為細胞變圓、皺縮 , 部份貼壁不良、脫落 , 裂解成碎片 , 折光度下降 , 細胞活力也明顯下降 , 且呈劑量依托關(guān)系 , 故本實驗選用 10 mmol/L Glu 為造模濃度 ( 見表 1) 。尼莫地平及 - 細辛醚預孵育 4 h, 其細胞形態(tài)無明顯轉(zhuǎn)變。表 1 不同濃度 Glu

10、對 PC12細胞活力的阻礙 ( 略) 注：與正常對照組比較 ,*P 。- 細辛醚對造模 PC12細胞活力、谷氨酸的阻礙( 見表 2) 表 2 - 細辛醚對造模 PC12細胞活力和 LDH的阻礙（略）注：與正常對照組比較 ,*P ,*P ；與 Glu 組比較 ,P, P( 下同 ) 。- 細辛醚對造模 PC12細胞凋亡率、胞漿游離鈣的阻礙( 見表 3) 表 3 - 細辛醚對造模 PC12細胞凋亡和細胞內(nèi)鈣離子濃度的阻礙 ( 略)討論PC12 細胞株來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞, 生長迅速、穩(wěn)固 , 不易發(fā)生自動轉(zhuǎn)化 , 可成立能傳代的二倍體細胞系 1 。其細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能皆類似于神經(jīng)細胞

11、 , 成為最近幾年來研究神經(jīng)細胞遞質(zhì)合成、貯存和釋放、離子通道規(guī)律及受體的細胞模型 2 。Glu 是一種中樞興奮性氨基酸遞質(zhì), 過量的 Glu 可促使突觸前過量的蛋白激酶C(PKC)向細胞膜轉(zhuǎn)移并活化 , 從而過度激活突觸后膜的 Glu 受體 NMDA受體 , 促使 Ca2+內(nèi)流。細胞內(nèi) Ca2+濃度上升又可激活細胞內(nèi)的硫蛋白酶 (calpin-I), 引發(fā)細胞內(nèi)骨架蛋白 -fordrin 降解, 使膜上 Glu 結(jié)合位點數(shù)量明顯增加 , 致使胞內(nèi) Ca2+超載 , 顯現(xiàn)遲發(fā)性損害 3 。本實驗用 Glu 造成 PC12細胞損傷 , 通過觀看和檢測細胞形態(tài)學、細胞存活力、 LDH 釋放量和細胞

12、凋亡和細胞內(nèi)鈣離子濃度的轉(zhuǎn)變, 探討 - 細辛醚對 PC12細胞 Glu 損傷的愛惜作用及其作用機理。本研究結(jié)果說明 ,PC12 細胞受到 Glu 損傷后 , 細胞存活率降低、 LDH 漏出率升高、細胞凋亡率和死亡率升高、細胞內(nèi)鈣離子濃度升高；- 細辛醚能提高細胞存活率、 降低 LDH漏出率、抑制細胞凋亡和死亡、降低細胞內(nèi)鈣離子濃度。 - 細辛醚與 PC12細胞預溫育 4 h, 可選擇性降低 Glu 引發(fā)的細胞內(nèi)游離 Ca2+濃度的異樣升高 , 抑制細胞凋亡 , 這可能是 - 細辛醚能特異性且劑量依托性地抑制 Glu 與其受體相結(jié)合 , 從而抑制受體門控鈣通道的開放 , 減少胞外游離鈣進入細胞內(nèi) , 減輕 Glu 的興奮性毒性有關(guān) , 從分子水平上初步說明了 - 細辛醚對興奮性神經(jīng)毒的愛惜作用機制。興奮性氨基酸對神經(jīng)細胞的損傷作用老是伴隨著鈣超載現(xiàn)象 , 筆者以為 , - 細辛醚對 Glu 引發(fā)的 PC12細胞損傷的愛惜作用可能與其鈣拮抗作用有關(guān)。【參考文獻】張均田 , 張慶柱 . 神經(jīng)藥理學研究技術(shù)與方式 M. 第 2 版. 北京：人民衛(wèi)生出版社 ,.Shafter TJ, Atchison WD. Transmitter, ion channelandreceptorpropertiesofPC12cells： amodelforneurotoxicologicals