蛋白酶的發(fā)酵及酶活力測定實驗報告

1、蛋白酶的發(fā)酵及酶活力測定試驗報告學(xué)院：生物科學(xué)與工程學(xué)院專業(yè)： 生物技術(shù)班級： 1姓名：學(xué)號：摘要：蛋白酶是一類重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑、皮革、釀酒等行化劑,它具有催化反響速度快,無工業(yè)污染,催化反響條件適應(yīng)性寬等的性質(zhì)和優(yōu)點。由于從植物和動物中生產(chǎn)蛋白酶具有的局限性,為了滿足當(dāng)今世界市場的需要,人們越來越多地把 目光投到微生物蛋白酶上2。微生物由于具有生長速度快、所需生長空間小、廣泛的生化多樣性及其遺傳可操作性等特點,因而備受人們青睞。本文主要進展了菌種的生長曲線的繪制與菌種最正確發(fā)酵產(chǎn)酶時間等方面的爭辯。關(guān)鍵字：蛋白酶生長曲線 酶活力第一章前言爭辯的目的與意義蛋白酶是工

2、業(yè)酶中用得最多的一種酶，是催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的一類酶,它作用于蛋白 質(zhì),將其分解為蛋白胨、多肽及游離氨基酸 1 ，約占酶總量的 60%，其中堿性蛋白酶就占25%。有調(diào)查顯示，酶制劑市場量最大的是洗滌劑用酶，其次位是淀粉加工用酶，以后依次 2。與動、植物來源的蛋白酶相 比，利用微生物產(chǎn)的蛋白酶有易于培育、生長快、產(chǎn)量高、易于提取，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，培育基的本錢相對較低等優(yōu)點，使微生物成為生產(chǎn)蛋白酶的重要來源和首選材料。國內(nèi)外爭辯概況微生物蛋白酶的分類由于從植物和動物中生產(chǎn)蛋白酶具有的局限性,為了滿足當(dāng)今世界市場的需要,人們越來越多地把目光投到微生物蛋白酶上3白酶按其作用的 pHpH 值分別為

3、堿性、中性及酸性。在食品工業(yè)中的應(yīng)用 化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。食品加工使用的蛋白酶通常來自于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、米曲霉和黑曲霉等。 溫度下，可以斷裂蛋白質(zhì)中的某些肽鍵，提高肉的嫩度，使肉變得多汁、松軟、易于咀嚼， 混合時間和增加面包產(chǎn)量。使用細菌蛋白酶可以增加面團的延展性4。本試驗的爭辯內(nèi)容能。其次章材料與設(shè)備菌種產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌培育基牛肉膏蛋白胨培育基酪素培育基主要試劑材料0.4mol/L0.4mol/L0.5mol/LNaOH1mol/L0.1mol/L(pH=10.5)、10g100ug/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液主要儀器設(shè)備UV1000 分光光度計、恒溫水浴鍋、量筒、

4、容量瓶、漏斗、試劑瓶、移液槍、吸管、離心管、槍頭、搖床、培育基第三章分析測定方法福林-酚試劑法福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物復(fù)原呈藍色(鉬藍和鎢藍混合物)，由于蛋白 質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反響。因此可利用此原理測定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在肯定pH 值和溫度條件下，同酶Na2CO3 堿化，再參加福林-酚試劑顯色，藍色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比;酪氨680nm蛋白酶活力測定方法按中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SB/T 10317-2022：蛋白酶活力測定法5 定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作酪氨酸標(biāo) 取100ug/ml加 0.4mol/

5、L加福爾馬 測定管號準(zhǔn)溶液的 氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度ug/ml的體積mlml的碳酸鈉溶液的體積ml林的體積mlOD680A000.01.05.001.0001100.10.95.001.000.0892200.20.85.001.000.1793300.30.75.001.000.3534400.40.65.001.000.4795500.50.55.001.000.51840+0.220min680nm，10mmA酸的濃度COD680=1K計算出OD680=1 時的濃度，即為吸光常數(shù)K 值，K=88.28。酶活力數(shù)值計算：X= AK4/10n式中：X樣品的酶活力，U/mL；A樣品平行試驗的平均吸光

6、度；K吸光常數(shù)；4反響試劑的總體積，mL；10反響時間 10min，以 1min 計；n稀釋倍數(shù)。所得結(jié)果表示至整數(shù)。第四章試驗方法試驗流程培育基的配置活化菌種培育取樣標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、生長曲線繪制和酶活測定培育基的制備牛肉膏蛋白胨培育基制備配方：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水1000ml、pH7.07.2、121滅菌20min。酪素培育基制備3g/L5g/L 酪素 10g/L NaCl 4-5g/L PH7.27.4 先將酪素用少量2%10-15mi，補足1000mL蒸餾水，參加其他成分，調(diào)PH分裝滅菌。菌種活化將篩選好的并保藏在冰箱里中的未知的產(chǎn)蛋白酶試驗菌接種2150

7、ml基牛肉膏蛋白胨培育基250ml30-32 搖瓶發(fā)酵，在搖床里 30震蕩1618試劑的配制2022mL100g(Na2WO4.2H2O)、25g700mL50mL85%的磷酸及濃鹽酸l00mL，充分混合后，接上回10h150g(LiSO450mL水，再連續(xù)沸騰 15min，以驅(qū)除過量的溴，冷卻后濾液呈黃綠色(如仍呈綠色，需再重復(fù)滴1000mL可長期保存?zhèn)溆?。此溶液使用時可按1:30.4mol/L(TCA)溶液準(zhǔn)確稱取TCA65.4g，加去離子水定容至 1000mL。0.4mo1/L準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉 42.4g1000mL。氫氧化鈉溶液c(NaOH)=0. 5mol/L鹽酸溶液c(HCI)=

8、lmol/L0. lmol/L磷酸緩沖液(pH=7.5 )，適用于中性蛋白酶稱取磷酸氫二鈉(Na,HP0,12H,0)6. 02 g 和磷酸二氫鈉(NaH,PO,2H,0)0. 5g ，加水溶解并定容至I000mLl0g/L稱取酪素 1.000g0.00 lg0.5m ol/L各種適宜pH80mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)人100mL 容量瓶中，用適宜的pH 緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。100g/mL0.100g 酪氨酸，逐步參加lmol/L6ml0.1mol100mL 1mg/ml10ml0.1mol100ml4產(chǎn)蛋白酶菌生長曲線的測定獵取不

9、同培育時間發(fā)酵液202212118:001000ul的移液槍吸取5ml的對數(shù)期菌液參加到發(fā)酵瓶A液體為酪素培育基剩下的對數(shù)期菌種菌液置于4A 號發(fā)酵瓶放到搖床中30 20:00活化的對數(shù)期菌種5mlB30的搖床中連續(xù)發(fā)酵。202212128：00活化的對數(shù)期菌種取出5ml 接種到CA、B、C5ml應(yīng)的離心管中。A12、13、14、15、16、17、18 對應(yīng)培育時間為24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h。B6、7、8、9、10、1112h14h16h18h20h20hC0、1、2、3、4、50h、2h、4h、6h、8h、10h4吸光度值的測定將編號 0、1、2、3、4、5、6

10、、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 的離心管從冰箱里取出，用離心機在設(shè)定的轉(zhuǎn)速為3500rpm,離心 10min,將要測酶活力的的編號的上清液倒入另一干凈的試管中。沉淀留下。離心管中參加蒸餾水5ml稍微震蕩制成懸浮液。將懸浮液加到比色皿中，測其吸光度值。 測定的OD 值填入下表。600比照01234比照012345678024681012141600.1820.3470.4520.6780.9060.9130.9651.3191.546910111213141516171818202224262830323436OD600編號 發(fā)酵時間(h)光密度OD6001.

11、585 1.726 1.7421.8251.9191.9761.981 1.970 2.0412.151酶活力的測定1待測液的制備：0、6、12、18、24、30、36h測酶液。將酪素、三氯乙酸溶液放入400.2C 恒溫水浴鍋中，預(yù)熱 5min。按下表操作：試管 A空白 加酶液 1.00 mL 400.2C，2min試管 B酶試樣，需作三測量平行加酶液 1.00 mL 400.2C，2min加三氯乙酸 加三氯乙酸 2.00 mL搖勻加酪素 1.00ml搖勻400.2C，10min400.2C，10min加酪素 1.00ml搖勻加三氯乙酸 2.00 mL搖勻取出靜止 10min，過濾取出靜止 1

12、0min，過濾取 1.00mL 濾液取 1.00mL 濾液加碳酸鈉溶液 5.0mL加碳酸鈉溶液 5.0mL加福林酚試劑 1.00mL加福林酚試劑 1.00mL400.2C 顯色 20min400.2C 顯色 20min于 680nm 波長，用 10mm 比色皿于 680nm 波長，用 10mm 比色皿測其吸光度測其吸光度將測定的OD680填入下表培育時間h0OD680AOD680A000.3070.307600.5570.5571200.6060.6061800.7650.7652400.9860.9863001.2251.2253601.3371.3375.1依據(jù)酶活計算公式將數(shù)據(jù)填入下表培育時間h061218243036酶活力(U/ml)1120212735434736h 左右酶活力到達最大，此時發(fā)酵液中的產(chǎn)蛋白酶最多。所以在選擇發(fā)酵時間時，應(yīng)選擇36h把握了蛋白酶產(chǎn)生菌的生長曲線繪制方法，同時通過爭辯蛋白酶的性質(zhì)及學(xué)習(xí)其測定方法， 用微生物學(xué)方法測定蛋白酶的酶活力。第六章參考文獻lMalaBRao,APamaM.talkasle,MohiniS.Ghatge,etaL.Molecularandiotechologlealaspects of microbial proteaseM.M