溶血磷脂酸對嗅鞘細(xì)胞形態(tài)增殖及表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響

1、溶血磷脂酸對嗅鞘細(xì)胞形態(tài)增殖及表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響【關(guān)鍵詞】溶血磷脂酸嗅鞘細(xì)胞Keyrds：lysphsphatidiaid;lfatryensheathingells;rphlgy;prliferatin;brain-derivedneurtrpifatr1材料和方法1.1材料1.2方法1.2.3Es的鑒定利用Es的特異性標(biāo)志物p75作細(xì)胞免疫熒光染色進(jìn)展鑒定。用40gL的多聚甲醛固定30in，0.01lL的PBS沖洗3次，加50g/L的牛血清白蛋白封閉液封閉60in后，參加兔抗p75抗體(1200)4孵育過夜，0.01lL的PBS沖洗3次，參加FIT標(biāo)記的由羊抗兔IgG(1200)

2、37孵育1h，0.01lL的PBS沖洗3次。對照實(shí)驗(yàn)將一抗用0.01lL的PBS代替，其余步驟同上，結(jié)果為陰性。對p75呈陽性反響的細(xì)胞鑒定為Es。Es純度通過隨機(jī)選取200倍視野，分別于明場下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及熒光視野下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出二者陽性細(xì)胞的平均比例。1.2.4LPA的稀釋和實(shí)驗(yàn)分組LPA的稀釋按照文獻(xiàn)7的方法進(jìn)展。以下操作均按照培養(yǎng)液中LPA的濃度的不同分為5個實(shí)驗(yàn)組：1L、5L、10L、20L、50L組。對照組培養(yǎng)液中參加含10g/L無脂肪酸牛血清白蛋白的PBS。1.2.6TT檢測LPA干預(yù)后Es的增殖活力純化的Es以1104l的密度接種到左旋多聚賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中，

3、每孔100l，培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，用DEF-12洗滌3次，更換為N2培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。再用各濃度的LPA干預(yù)，每組24孔。分別在LPA干預(yù)后12、24、36、48、60、72、84、96h，每組取3孔各參加10l的TT，作用濃度為5gL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清，每孔參加100l的DS，待藍(lán)色結(jié)晶溶解后用酶鏈免疫檢測儀測定D值(檢測波長為490n)，繪制細(xì)胞生長曲線，對照組亦按一樣方式處理。1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)展分析，數(shù)據(jù)以(s)表示，做樣本均數(shù)t檢驗(yàn)或者單因素方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.2TT檢測結(jié)果結(jié)果顯示，LPA促進(jìn)Es增殖

4、呈現(xiàn)時間和濃度依賴性：干預(yù)后12h各實(shí)驗(yàn)組與對照組D值比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);10L組發(fā)揮促增殖作用最快，干預(yù)后24h即高于對照組(P0.01);3696h各濃度LPA均能顯著促進(jìn)增殖，與對照組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；各實(shí)驗(yàn)組均在LPA干預(yù)后60h到達(dá)增殖頂峰，與之前時間點(diǎn)比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，之后進(jìn)入平臺期，而對照組各時間點(diǎn)的D值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；干預(yù)后12h10L組D值與其他實(shí)驗(yàn)組比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，干預(yù)后24h高于1、50L組(P0.05)，3696h均高于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.05)。見表2。2.3esternBlt檢測結(jié)

5、果結(jié)果顯示，LPA干預(yù)后60h各實(shí)驗(yàn)組BDNF的表達(dá)量均高于對照組(P0.01)，1、5、10、20L組BDNF表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，而50L組BDNF表達(dá)量低于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.05)。見圖5。3討論LPA促細(xì)胞增殖的機(jī)制主要是通過Gi/蛋白激活Ras下游的絲裂原活化蛋白激酶，引起細(xì)胞增殖。LPA發(fā)揮促增殖作用的濃度較廣，從0.01L9到50L10的LPA都具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。Yan等11只是研究了05L的LPA對Es的促增殖作用，發(fā)現(xiàn)LPA發(fā)揮促增殖作用的最低濃度為0.1L，1L時作用最大。本實(shí)驗(yàn)觀察到，150L的LPA均能促進(jìn)增殖，濃度低于10L時促增殖作用隨濃度升高

6、呈遞增趨勢，而高于此濃度促增殖作用隨濃度升高呈下降趨勢。這種濃度依賴性可能與LPA受體有關(guān)。與細(xì)胞增殖有關(guān)的LPA受體主要有3種，分別為LPA13受體，這些受體廣泛分布在Es及多種類型的細(xì)胞中。LPA1、LPA2為高親合力受體。LPA3為低親合力受體。LPA與受體結(jié)合時，首先與LPA1、LPA2結(jié)合，當(dāng)其結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)后才與LPA3結(jié)合。盡管這3種受體都能激活A(yù)PK，但它們的作用并非一致12。當(dāng)LPA與LPA1、LPA2結(jié)合時，那么表現(xiàn)出促增殖抗凋亡作用，而與LPA3結(jié)合時，那么傳遞促凋亡信號13。因此，當(dāng)LPA到達(dá)一定濃度后，LPA將與LPA3受體結(jié)合，細(xì)胞增殖受到抑制。Es能表達(dá)并分泌BD

7、NF。LPA可能通過下述機(jī)制上調(diào)Es表達(dá)BDNF：通過Gq蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶，經(jīng)磷酸肌醇循環(huán)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣發(fā)動，隨后鈣通道孔徑發(fā)生改變，又使細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，引起胞內(nèi)鈣程度上升14，進(jìn)而激活BDNF基因啟動子P、P15，16。本實(shí)驗(yàn)觀察到，150L的LPA較對照組均顯著上調(diào)了BDNF的表達(dá)，但當(dāng)濃度升高到50L時BDNF的表達(dá)較其他濃度明顯下降。BDNF表達(dá)下降的原因可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子程度過高引起鈣超載有關(guān)。研究說明，LPA的促鈣離子內(nèi)流作用具有濃度依賴性，超過一定劑量可引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載17。另外，BDNF本身也可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子程度升高，甚至可以到達(dá)誘發(fā)細(xì)胞去極化的程度18。由于Es本身也存在BDNF的受體，因此Es可受到自分泌BDNF的影響而發(fā)生鈣超載。鈣超載發(fā)生后那么引起細(xì)胞一系列的功能障礙，最終導(dǎo)致Es表達(dá)BDNF下降。值得注意的是，雖然LPA可通過Gi/蛋白偶聯(lián)受體途徑促進(jìn)Es增殖，但近來研究說明BDN