纖維素酶在提取長春花堿中的應用

1、纖維素酶在提取長春花堿中的應用【摘要】目的研究纖維素酶在提取長春花生物堿中的應用。方法采用酸水浸提法和酶浸提法提取長春花中的長春堿、長春質(zhì)堿、文多林，高效液相色譜(HPL)法測定其含量。結果酸水浸提法和酶浸提法提取的長春堿、長春質(zhì)堿、文多林含量分別為0.0158和0.0052g/l;0.0456和0.0204g/l;0.0898和0.0421g/l。結論在單位時間內(nèi)酶提法可顯著進步長春堿、長春質(zhì)堿、文多林的收率，可考慮將酶解法用于工業(yè)上長春花生物堿的提取中?！娟P鍵詞】長春花;長春堿;長春質(zhì)堿;文多靈;纖維素酶Abstrat：bjetiveTstudytheeffetfellulseenzyen

2、extratinfalkalidfratharanthusrseus.ethdsHPLethdasusedtdeterinethententsfvinblastine,atharanthineandvindlinefr.rseus.Resultsparediththetraditinalaidiaterextratin,theenzyatiethdextratinyieldfvinblastine,atharanthineandvindlineasinreasedrespetively.nlusinTheyieldfvinblastine,atharanthineandvindlinefr.r

3、seusanbeeffetivelyinreasedbyusingenzyatiextratinpress.Itisavailabletuseenzyeinextratinalkalidfr.rseus.Keyrds：atharanthusrseus;Vinblastine;atharanthine;Vindline;ellulseenzye長春花atharanthusrseus(Linnaeus)G.Dn是夾竹桃科(Apynaeae)長春花屬一種重要的藥用植物。長春花植株中含有極其復雜的萜類吲哚生物堿家族，其中的長春堿(Vinblastine)為目前應用最廣泛的天然植物抗腫瘤藥物之一，可用于

4、治療何杰金氏并惡性淋巴腫瘤等疾病1，2。而長春質(zhì)堿(atharanthine)、文多林(Vindline)是半合成另一癌癥治療一線藥物長春瑞濱的原料3。目前工業(yè)上長春花生物堿的提取方法主要為酸水浸提法，該方法存在著有效成分提取率低、耗時較長的問題。近年來，纖維素酶的應用日益廣泛，特別是在提取天然產(chǎn)物中的有效成分，纖維素酶可將植物細胞壁破壞并將纖維素軟化，能使細胞內(nèi)的有效物質(zhì)充分釋放出來，較大幅度進步天然植物中有效成分的提取率4。本實驗用纖維素酶浸提長春花粉末提取長春花生物堿，顯著進步了長春堿、長春質(zhì)堿、文多林的提取率，縮短了提取時間，且用纖維素酶提取長春花生物堿尚無同類報道。1儀器與試藥1.1

5、儀器aters1525型高效液相色譜儀，2487型紫外檢測器;電子天平BT2202S(日本島津);PB20型精細pH計(上海雷磁儀器廠)。1.2試藥纖維素酶(天津奧凱實業(yè));長春堿、長春質(zhì)堿、文多林(純度98%)，均為自制;長春花采于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所南藥種質(zhì)圃;甲醇、乙腈為色譜純，氨水、二乙胺、磷酸為分析純，水為二次蒸餾水;所有試劑在使用前均經(jīng)0.45微孔濾膜過濾。2方法與結果2.1色譜條件色譜柱為HypersilBDS-18(4.6250，5)柱;流動相為380l水-二乙胺(98614，用磷酸調(diào)pH7.2)與620l甲醇-乙腈(41)混合;流速1.0l/in;柱溫為2

6、5;檢測波長260n;進樣量10l。色譜圖見圖1。1.文多林2.長春質(zhì)堿3.長春堿圖1混合對照品(A)和長春花酶提取樣品(B)的HPL圖譜2.2標準品溶液的制備精細稱取適量長春堿、長春質(zhì)堿、文多林對照品，用5l甲醇溶解并置于同一容量瓶中，搖勻，用甲醇定容。三者配置的濃度分別為0.3586，0.4842和0.9546g/l。保存于4冰箱備用。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3供試品溶液的制備2.3.1酸水浸提法精細稱取長春花全草粉末20g，精細參加pH4.0的酸水溶液200l，置于恒溫水浴12h。濾過，濾液加氨水調(diào)pH值至8.0，以200l的四氯化碳分5次等量萃取，合并萃取液揮干。殘渣加甲醇適量溶解，

7、置50l容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。置冰箱備用，上樣前經(jīng)0.45微孔濾膜過濾。2.3.2酶浸提法精細稱取長春花全草粉末20g，精細參加含0.5g纖維素酶pH4.0的酸水溶液200l，置于恒溫水浴12h。后續(xù)處理方法同酸水浸提法。2.4線性關系考察分別精細量取上述對照品溶液各0.20，0.40，0.60，0.80，1.00l分別置于10l容量瓶中，搖勻，用甲醇定容。精細汲取各濃度溶液10l注入液相色譜，按“2.1項下色譜條件測定相應HPL圖譜的峰面積。以長春堿、長春質(zhì)堿、文多林進樣量X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。表1各長春花生物堿標準曲線回歸方程和線性范圍2

8、.5精細度實驗上述條件下，對同一混合對照品溶液重復測定7次，測得峰面積的RSD分別為：長春堿0.58%，長春質(zhì)堿0.82%，文多林0.54%，說明精細度較好。2.6重復性實驗對同一批樣品按供試品溶液的制備方法平行制備5份，分別進樣10l，同時取混合對照品溶液10l進樣測定，按外標法測定其含量，結果證明重復性良好，RSD分別為:長春堿0.56%，長春質(zhì)堿0.45%，文多林1.3%。2.7穩(wěn)定性實驗按“2.1項下色譜條件，對同一供試品，在保存0，4，8，12，24h后，用當日新配置的對照品溶液按外標法測定相應的峰面積，并計算長春堿、長春質(zhì)堿和文多林的RSD分別為:長春堿0.89%，長春質(zhì)堿0.76

9、%，文多林0.38%，說明這3種成分在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.8回收率實驗分別精細稱取含量的同一長春花全草粉末6份，分別定量參加混合對照品溶液各0.5，0.5，1.0，1.0，2.0，2.0l，按樣品溶液制備方法回收供試品溶液，并按上述色譜條件進展測定，計算回收率，結果見表2。表2各長春堿回收率實驗結果2.9樣品含量測定精細汲取經(jīng)0.45濾膜濾過的樣品溶液10l，分別注入高效液相色譜儀中，根據(jù)峰面積由標準曲線計算出兩種方法提取的長春堿、長春質(zhì)堿、文多林含量。兩種方法提取長春堿、長春質(zhì)堿、文多林含量結果見表3。表3長春花提取液中各生物堿含量的測定結果3結論與討論從纖維素酶提取長春花中長春堿、長春質(zhì)堿、

10、文多林實驗中，可以初步看出，在纖維素酶的作用下，長春堿、長春質(zhì)堿提取量大大進步，由t檢驗可以看出P0.01，兩種工藝提取方法比照，有顯著差異。由于實驗是在實驗條件完全平行的情況下進展，因此可以否認由于實驗不平行引起的提取量的差異。用纖維素酶酶解后提取，長春堿、長春質(zhì)堿的提取量比酸水浸提法進步了近3倍，而文多林的提取量也有少量增加，這是由于纖維素酶具有分解纖維素、破壞細胞壁的作用，使被細胞壁包裹的成分易于溶出。實驗發(fā)現(xiàn)，用酸水浸提6h后，文多林的提取率變化就不明顯，而長春堿、長春質(zhì)堿至少經(jīng)10h的酸水浸提，才能有效溶出。本實驗是在一定的酶量和溫度下進展，是否應該進展正交實驗進一步優(yōu)化提取條件有待進一步的研究。是否將酶法用于長春花提取的工業(yè)化中，還因考慮酶對提取物有何影響，是否會引起藥理作用的變化等，都有待進一步的深化研究?！緟⒖嘉墨I】1徐任生，陳仲良.中草藥有效成分提取與別離.上海