代謝物酶法分析技術(shù)課件

1、 第五章 代謝物酶法分析技術(shù)江蘇大學(xué) 鄭鐵生全國(guó)高等醫(yī)藥院校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)規(guī)劃教材 臨床生物化學(xué)檢驗(yàn) （第二版）. 第五章 江蘇大學(xué) 鄭鐵生全國(guó)高等醫(yī)藥院校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)教學(xué)目標(biāo)與要求掌握：代謝物酶法分析技術(shù)的概念，單酶反應(yīng)直接法、酶促偶聯(lián)法等方法的設(shè)計(jì)原理，脫氫酶和過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)的應(yīng)用原理，以及平衡法和速率法的設(shè)計(jì)要求。熟悉：代謝物酶法分析技術(shù)的理論基礎(chǔ)，酶循環(huán)法、酶活性恢復(fù)法、激活劑和抑制劑測(cè)定法的設(shè)計(jì)原理，平衡法和速率法的優(yōu)缺點(diǎn)。了解：試劑酶的質(zhì)量要求，以及代謝物酶法分析技術(shù)的發(fā)展前景。.2教學(xué)目標(biāo)與要求掌握：代謝物酶法分析技術(shù)的概念，單酶反應(yīng)直接法代謝物酶法分析技術(shù)是指用酶法分析的方法

2、來(lái)測(cè)定人體內(nèi)的代謝物或代謝產(chǎn)物的技術(shù)。 酶法分析（enzymatic method）是以酶為試劑測(cè)定酶促反應(yīng)的底物、輔酶、輔基、激活劑或抑制劑，以及利用酶促反應(yīng)測(cè)定酶活性的一類方法。 代謝物酶法分析技術(shù)的概念.3代謝物酶法分析技術(shù)是指用酶法分析的方法來(lái)測(cè)定人體內(nèi)的代謝物或目錄 代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)1代謝物酶法分析的方法 2代謝物酶法分析的設(shè)計(jì)要求 3小結(jié)與展望4返回總目錄.4目錄 代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)1代謝物酶法分析的方法 2 代謝物酶法分析 平衡法（終點(diǎn)法） 速率法（動(dòng)力學(xué)法） 代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)1.5 代謝物酶法分析 平衡法（終點(diǎn)法）代謝物酶法分析的理論平衡法是指標(biāo)本中待測(cè)物

3、的量有限，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)逐漸被消耗，當(dāng)剩余的底物量很小（1%5%）時(shí)，指示反應(yīng)信號(hào)逐漸達(dá)到平衡，即通常所說(shuō)的終點(diǎn)，所以又稱為終點(diǎn)法(end-point method)。 平衡法的特點(diǎn)是測(cè)定底物的總變化量， 即測(cè)定的是“濃度”。平衡法基本理論(1).6平衡法是指標(biāo)本中待測(cè)物的量有限，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)逐漸被消耗，當(dāng)剩積分得： 米氏方程 改寫為 式中S0為待測(cè)物，St為待測(cè)物至反應(yīng)t時(shí)間后的濃度。平衡法基本理論(1).7積分得： 米氏方程 改寫為 式中S0為待測(cè)物，St為若反應(yīng)達(dá)到平衡，假設(shè) ，即 S0St S0， 以上積分式： 則可簡(jiǎn)化為：說(shuō)明達(dá)到平衡所需的時(shí)間與Km、Vmax、S0有關(guān)，Km越小、Vm

4、ax越大（加入酶量越多）、S0越?。ù郎y(cè)物越少）則達(dá)到平衡所需的時(shí)間越短。平衡法基本理論(1).8若反應(yīng)達(dá)到平衡，假設(shè) ，即 S0St若 S0 Km 積分得： 可簡(jiǎn)化為： 若同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)管，不管反應(yīng)到達(dá)何種程度，只要標(biāo)準(zhǔn)管與測(cè)定管反應(yīng)時(shí)間（t）一致，則有：平衡法基本理論(1).9若 S0 Km 積分得： 可簡(jiǎn)化為： 若同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)管 標(biāo)準(zhǔn)管的 S0St 與待測(cè)管的 S0St 分別代表消耗量，也代表轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，可以用產(chǎn)物的吸光度來(lái)表示（As和Au）。標(biāo)準(zhǔn)管的S0與測(cè)定管的S0分別表示為Cs和Cu?？珊?jiǎn)化為： 平衡法基本理論(1).10 標(biāo)準(zhǔn)管的 S0St 與待測(cè)管的 S0St當(dāng) S0St S0，

5、即反應(yīng)基本達(dá)到平衡，Au和As基本穩(wěn)定不變，此時(shí)測(cè)定誤差最小。如果存在基質(zhì)效應(yīng)，兩者反應(yīng)程度不一，若按上式計(jì)算就會(huì)帶來(lái)誤差。此式是平衡法測(cè)定代謝物的基本原理此公式成立是前提條件平衡法基本理論(1).11當(dāng) S0St S0，即反應(yīng)基本達(dá)到平衡，A速率法(rate assay)又稱動(dòng)力學(xué)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法，測(cè)定的是速率（通常指的是初速度），依據(jù)是當(dāng)?shù)孜锏南牧枯^小時(shí)(5%)，酶促反應(yīng)呈一級(jí)反應(yīng)，此時(shí)的反應(yīng)速度（v）與代測(cè)物的濃度成正比例。速率法的關(guān)鍵是如何使酶促反應(yīng)成一級(jí)反應(yīng)。 速率法基本理論(2).12速率法(rate assay)又稱動(dòng)力學(xué)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法，測(cè)定根據(jù)米氏方程： 當(dāng)S Km，則S +

6、Km Km當(dāng)酶量固定不變時(shí)，酶促反應(yīng)的 最大速度Vmax也不變符合一級(jí)酶促反應(yīng)米氏方程改為： 速率法基本理論(2).13根據(jù)米氏方程： 當(dāng)S Km，則S + Km 若同時(shí)帶標(biāo)準(zhǔn)管，則有：標(biāo)準(zhǔn)管的S0與測(cè)定管的S0分別表示為Cs和Cu，速度用 A/min來(lái)表示。上式改寫為：速率法測(cè)定代謝物濃度的原理 前提條件是測(cè)定初速度。越偏離初速度，測(cè)定誤差則越大。速率法基本理論(2).14若同時(shí)帶標(biāo)準(zhǔn)管，則有：標(biāo)準(zhǔn)管的S0與測(cè)定管的S0分別在臨床操作中，只要測(cè)定期間待測(cè)物消耗 5%，只要測(cè)定兩個(gè)固定時(shí)間的吸光度差值，就可以采用標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)照法計(jì)算樣本濃度，這種方法又稱為固定時(shí)間法(fixed assay)。

7、速率法基本理論(2).15在臨床操作中，只要測(cè)定期間待測(cè)物消耗 Km2，這時(shí)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可按單底物法處理，整個(gè)反應(yīng)只與待測(cè)物有關(guān)，呈一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。 但在以NADH 或NADPH 為底物的終點(diǎn)法測(cè)定中，因340 nm 吸光度的限制，輔酶的用量不可能過(guò)高。 .20雙底物反應(yīng)直接測(cè)定法 對(duì)于雙底物反應(yīng)，為了便于實(shí)驗(yàn)分析，在實(shí)在340 nm 處測(cè)定吸光度的增加來(lái)進(jìn)行定量的方法乳酸測(cè)定雙底物反應(yīng)直接測(cè)定法 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+丙酮酸測(cè)定 在340 nm 處測(cè)定吸光度的下降來(lái)進(jìn)行定量的方法 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+.21在340 nm 處測(cè)定吸光度

8、的增加來(lái)進(jìn)行定量的方法乳酸測(cè)定雙酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物如果沒有可直接檢測(cè)的成分，將反應(yīng)某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個(gè)酶促反應(yīng)中，從而達(dá)到檢測(cè)目的的方法稱酶促偶聯(lián)法。 最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個(gè)：一個(gè)是脫氫酶指示系統(tǒng)，另一個(gè)為過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)。 酶偶聯(lián)法(2).22酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物如果沒有可直接檢測(cè)的成分，將反應(yīng)某一產(chǎn)物脫氫酶指示系統(tǒng) 氧化型輔酶NAD(P)+在340 nm 處沒有吸收峰, 還原型輔酶NAD(P)H在340 nm 處有吸收峰.23脫氫酶指示系統(tǒng) 氧化型輔酶NAD(P)+.23脫氫酶指示系統(tǒng) 以脫氫酶為指示酶的系統(tǒng)測(cè)定的是氧化型輔酶(NAD+) 或氧化型輔酶(NADP+)變?yōu)檫€原型NAD

9、(P)H后在340 nm 處的吸光度增高來(lái)計(jì)算出被測(cè)物的濃度，也可利用脫氫酶的逆反應(yīng)，將還原型NAD(P)H 變?yōu)檠趸蚇AD(P)+，測(cè)定340 nm 處吸光度的下降來(lái)計(jì)算被測(cè)物的濃度。 .24脫氫酶指示系統(tǒng) 以脫氫酶為指示酶的系統(tǒng)測(cè)定的是氧化型輔酶(脫氫酶指示系統(tǒng) 血清葡萄糖己糖激酶法測(cè)定 Glu + ATPG-6-P+ADPG-6-P + NADP+P-6-GA + NADPH + H+指示酶反應(yīng)將NADP+轉(zhuǎn)化為NADPH + H+，測(cè)定340 nm吸光度上升的速度與葡萄糖的含量成正比 .25脫氫酶指示系統(tǒng) 血清葡萄糖己糖激酶法測(cè)定 Glu + ATP脫氫酶指示系統(tǒng) 血清尿素測(cè)定 尿素

10、 + H2O2NH3 + CO2NH3 + -酮戊二酸 + NADH + H+谷氨酸 + H2O + NAD+測(cè)定340nm吸光度下降的速度與尿素的含量成正比，可以用速率法測(cè)定；也可以用平衡法測(cè)定 .26脫氫酶指示系統(tǒng) 血清尿素測(cè)定 尿素 + H2O2NH3 + 常用的試劑酶有乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。體液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、膽汁酸、乳酸、丙酮酸、酮體、乙醇、唾液酸以及氨、鉀、鎂等離子的酶法測(cè)定大多使用該指示系統(tǒng)。脫氫酶指示系統(tǒng) .27常用的試劑酶有乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng) 共用的指示反應(yīng)最早由Trinde

11、r氏等人提出，被稱為Trinder反應(yīng) 最大吸收峰為500nm，在可見光范圍內(nèi)比色。已廣泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、膽固醇、甘油三酯等項(xiàng)目的測(cè)定 .28過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng) 共用的指示反應(yīng)最早由Trinder氏等人過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng) 血清總膽固醇氧化酶測(cè)定法 膽固醇酯 + H2O膽固醇 + O2膽固醇 + 脂肪酸4-膽甾烯酮 + H2O2紅色醌類化合物H2O2 + 4-AAP + 酚指示酶反應(yīng)生成的紅色醌類化合物可在500 nm 處比色測(cè)定 .29過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng) 血清總膽固醇氧化酶測(cè)定法 膽固醇酯 + 化學(xué)名英文縮寫最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N

12、-乙基-N-（2-羥基-3-丙磺酰）間甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng) 常用的Trinder反應(yīng)生色基團(tuán) 表內(nèi)這些酚類衍生物，有的是提高生色基團(tuán)的穩(wěn)定性和溶解度、產(chǎn)物的靈敏度和穩(wěn)定性；有些生色基團(tuán)的產(chǎn)物是蘭色醌類，能避免溶血等色素干擾。 .30化學(xué)名英文縮寫最大吸收峰（nm）酚P500過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)利用底物和輔酶的反復(fù)反應(yīng)，使待測(cè)物的酶促反應(yīng)產(chǎn)物不斷擴(kuò)增，擴(kuò)增量決定于循環(huán)次數(shù)，反應(yīng)產(chǎn)物的增加，提高了檢測(cè)靈敏度，減少了共存物質(zhì)的干擾，達(dá)到高靈敏度和特異的要求。 酶循環(huán)法(enzy

13、matic cycling assay)的靈敏度決定于循環(huán)反應(yīng)速度和時(shí)間，循環(huán)反應(yīng)速度又取決于兩種試劑酶( Ea 和Eb) 的量。該法測(cè)定中所選擇酶的Km 值要小，以便用較少的酶量保持所需的靈敏度。 酶循環(huán)法(3).31利用底物和輔酶的反復(fù)反應(yīng)，使待測(cè)物的酶促反應(yīng)產(chǎn)物不斷擴(kuò)增使用兩種酶，即一種氧化酶用于靶物質(zhì)的氧化，一種脫氫酶使其回到還原狀態(tài)，促使靶物質(zhì)(或其衍生物)或靶物質(zhì)的氧化產(chǎn)物作為底物循環(huán)。檢測(cè)指示系統(tǒng)： 循環(huán)前、后用速率法測(cè)定NADH(340 nm) 的變化。檢測(cè)產(chǎn)物H2O2可通過(guò)Trinder 反應(yīng)比色測(cè)定。產(chǎn)物循環(huán)氧化酶脫氫酶系統(tǒng) .32使用兩種酶，即一種氧化酶用于靶物質(zhì)的氧化，

14、一種脫氫酶使其回到產(chǎn)物循環(huán)氧化酶脫氫酶系統(tǒng) 甘油濃度測(cè)定 通過(guò)GPO和G-3PDH使G-3P 與DHAP之間循環(huán)，在反復(fù)循環(huán)中G-3P 和DHAP 的量不變，而產(chǎn)物H2O2 隨每次循環(huán)不斷遞增，同時(shí)NADH 遞減。在規(guī)定時(shí)間t 內(nèi)，H2O2 累計(jì)的量決定于t 和每min循環(huán)次數(shù)。 .33產(chǎn)物循環(huán)氧化酶脫氫酶系統(tǒng) 甘油濃度測(cè)定 通過(guò)GPO和G-底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)用一種脫氫酶和兩種輔酶( thio-NAD+ 和NADH)。用395 nm 415 nm 波長(zhǎng)測(cè)定反應(yīng)中氧化型thio-NAD+ 轉(zhuǎn)為還原型thio-NADH的增加速度。循環(huán)反應(yīng)條件： 酶對(duì)thio-NAD+ 和NADH應(yīng)有高度親和力

15、。溶液pH 和緩沖體系同時(shí)有利于雙向反應(yīng)。thio-NAD+ 和NADH 二者的濃度和配比達(dá)最適條件。 .34底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)用一種脫氫酶和兩種輔酶( thio底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)血淸膽汁酸測(cè)定 膽汁酸與3-酮類固醇之間構(gòu)成循環(huán)，不斷產(chǎn)生硫代還原型輔酶（黃色），控制好條件，反應(yīng)速度與代測(cè)物膽汁酸呈正比。靈敏度可增加數(shù)十倍。 .35底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)血淸膽汁酸測(cè)定 膽汁酸與3-酮氨循環(huán)合成酶脫氫酶系統(tǒng) NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脫氨-NAD轉(zhuǎn)化為NAD+，經(jīng)脫氫酶將亮氨酸轉(zhuǎn)化為氧化異己酸和NH4+同時(shí)生成NADH，生成的NH4+進(jìn)入循環(huán)再次生成NADH，在340nm測(cè)

16、定。 .36氨循環(huán)合成酶脫氫酶系統(tǒng) NH4+在NAD合成酶和Mg2+酶循環(huán)法具有的特點(diǎn) 靈敏度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高靈敏度隨酶在擴(kuò)增反應(yīng)中的用量而提高利用酶對(duì)底物的特異性,使測(cè)定系統(tǒng)簡(jiǎn)化利用四唑鹽類的顯色反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)比色測(cè)定 .37酶循環(huán)法具有的特點(diǎn) 靈敏度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高.37酶活性恢復(fù)法 很多酶必需某些無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶存在才發(fā)揮其催化活性。脫去酶中關(guān)鍵的無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶之后，酶即失去了其催化活性，無(wú)活性的酶與標(biāo)本混合，標(biāo)本中的無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶使該酶重新復(fù)活，復(fù)活的比例可以反映這些無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶的含量。 其他酶法(4).38酶活性恢復(fù)法 很多酶必需某些無(wú)

17、機(jī)離子、微量元素或輔酶存在才發(fā)異檸檬酸脫氫酶法測(cè)定血清鎂離子 酶活性恢復(fù)法異檸檬酸+ NADP+-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制鈣離子，標(biāo)本中Mg2+通過(guò)恢復(fù)ICD 活性，催化異檸檬酸脫氫的正向反應(yīng)，使NADP+還原，與鎂標(biāo)準(zhǔn)一起在340nm測(cè)定吸光度的増加。 .39異檸檬酸脫氫酶法測(cè)定血清鎂離子 酶活性恢復(fù)法異檸檬酸+ NA酶活性恢復(fù)法應(yīng)用舉例丙酮酸激酶法或色氨酸酶法測(cè)定鉀離子-半乳糖苷酶法測(cè)定鈉離子淀粉酶法測(cè)定氯離子超氧化物歧化酶法測(cè)定銅離子碳酸酐酶或堿性磷酸酶法測(cè)定鋅離子等 .40酶活性恢復(fù)法應(yīng)用舉例丙酮酸激酶法或色氨酸酶

18、法測(cè)定鉀離子.40激活和抑制法 有機(jī)磷是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，用標(biāo)準(zhǔn)乙酰膽堿酯酶與標(biāo)本在37水浴10min，測(cè)定剩余的乙酰膽堿酯酶的活性，被抑制的乙酰膽堿酯酶的活性可以計(jì)算出標(biāo)本中有機(jī)磷的含量。有機(jī)磷的酶法測(cè)定根據(jù)酶有否激活劑和抑制劑存在時(shí)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變來(lái)測(cè)定激活劑和抑制劑的含量。另有抑制ALP法測(cè)定茶堿、激活HK法測(cè)定鎂離子等。返回章目錄.41激活和抑制法 有機(jī)磷是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，用標(biāo)準(zhǔn)乙酰膽堿酯試劑酶質(zhì)量試劑酶概念 試劑酶特征 試劑酶純度酶法設(shè)計(jì)要求 酶法設(shè)計(jì)共性要求 平衡法設(shè)計(jì)的要求 速率法設(shè)計(jì)的要求 代謝物酶法分析的設(shè)計(jì)要求 3試劑酶來(lái)源.42試劑酶質(zhì)量試劑酶概念 試劑酶

19、特征 試劑酶純度酶法設(shè)計(jì)要求 酶試劑酶是指作為診斷試劑來(lái)測(cè)定化合物濃度或酶活性的一類酶。它是酶試劑的核心，它的質(zhì)量是酶試劑質(zhì)量的決定性因素。試劑酶的質(zhì)量要求(1)試劑酶的概念.43試劑酶是指作為診斷試劑來(lái)測(cè)定化合物濃度或酶活性的一類酶。它是主要來(lái)自動(dòng)植物組織提取及微生物發(fā)酵工程?；蛑亟M酶蛋白也有應(yīng)用，活力高，雜酶含量少且價(jià)格低廉。 不同來(lái)源的同一種試劑酶有不同的理化特征。必須掌握專一性和分子量、等電點(diǎn)、Km、最適pH，最適溫度等，并熟悉輔助因子、激活劑和抑制劑對(duì)酶活性的影響。 試劑酶的來(lái)源和理化特征試劑酶的質(zhì)量要求(1).44主要來(lái)自動(dòng)植物組織提取及微生物發(fā)酵工程?；蛑亟M酶蛋白也有應(yīng)不同的

20、酶試劑系統(tǒng)對(duì)試劑酶的純度有不同的要求。以NAD(P)H為指示反應(yīng)中，要求試劑酶有較高的純度。而在Trinder反應(yīng)中要求相對(duì)低一些。 純度主要指標(biāo) 酶的比活性，酶的比活性越高，酶的純度越高。雜酶含量，容易引起副反應(yīng)的一些酶含量按 “允許限度”的要求（見表5-2）。 試劑酶的質(zhì)量要求(1)試劑酶的純度要求.45不同的酶試劑系統(tǒng)對(duì)試劑酶的純度有不同的要求。以NAD(P)H表5-2常用試劑酶的理化特征及質(zhì)量要求 名稱來(lái)源分子量等電點(diǎn)比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）葡萄糖氧化酶（GOD）A.nigerp.notatum186 000152 0004.3020蔗糖酶含量0.01%,過(guò)氧

21、化氫酶10U/mg蛋白己糖激酶(HK)酵母105 0004.50-4.80140磷酸葡萄糖異構(gòu)酶0.01%,G-6-P脫氫酶0.01%葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)酵母212 0004.50140己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶0.02%過(guò)氧化物酶(POD)辣根40 2007.2050不含胺氧化酶及過(guò)氧化氫酶.46表5-2常用試劑酶的理化特征及質(zhì)量要求 名稱來(lái)源分子量等電點(diǎn)名稱來(lái)源分子量等電點(diǎn)比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）脲酶巨豆483 0004.905-100天冬氨酸酶0.02%,精氨酸酶0.002%,NH4+0.0005g/U,谷氨酸脫氫酶(GLDH)變形桿菌300

22、 0004.6090醇脫氫酶、乳酶脫氫酶、蘋果酸脫氫酶0.01%乳酸脫氫酶 心135 0004.5-4.8500丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶0.01%,丙酮酸激酶、醛縮酶0.001%脂蛋白脂肪酶（LPL）心，假單胞菌屬47 0005.950.05100ATP酶0.00008%, NADH氧化酶0.001%,膽固醇氧化酶0.002%,過(guò)氧化氫酶0.02%甘油激酶（GK)嗜熱脂肪芽胞桿菌209 00085NADH氧化酶0.01%,己糖激酶0.02%.47名稱來(lái)源分子量等電點(diǎn)比活性雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）脲名稱來(lái)源分子量等電點(diǎn)比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）磷酸-3-甘油氧化酶足球菌76

23、0004.60.140乳酸氧化酶0.001%膽固醇酯酶(CEH)假單胞菌302 00025ATP酶0.00008, NADH氧化酶0.001%,GOD0.00001%,尿酸酶0.00004%,過(guò)氧化氫酶1U/mg膽固醇氧化酶(CHOD)鏈霉菌34 0005.1-5.425CEH0.005%,GOD0.00014%尿酸酶0.0004%膽紅素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌52 0004.100.2NADH氧化酶0.0007%尿酸酶肝100 0006.3015過(guò)氧化氫酶1.0%丙酮酸氧化酶260 0004.301.5ATP酶0.05% ，ALT、AST0.05%.48名稱來(lái)源分子量等電點(diǎn)比活性雜酶占試劑

24、酶活性的%磷酸-3-甘油所用試劑酶的特異性：指示酶要有更高特異性； 怎樣消除干擾因素：加消除劑、抑制劑和用雙試劑法；試劑中的附加劑：應(yīng)不抑制酶的活性，不影響試劑的穩(wěn)定性，不與底物和體液中的物質(zhì)作用；如何提高靈敏度：用PMS或黃遞酶，將NADH上的氫交給四氮唑鹽，在可見光監(jiān)測(cè)； 用酶循環(huán)法； 測(cè)定熒光法。酶法分析的設(shè)計(jì)要求(2)酶法設(shè)計(jì)的共性要求.49所用試劑酶的特異性：指示酶要有更高特異性； 酶法分析的設(shè)計(jì)要酶的用量要足夠大，能使反應(yīng)1 min3 min 達(dá)到平衡，以保證較快完成測(cè)定。反應(yīng)要朝正反應(yīng)方向進(jìn)行，如果反應(yīng)的平衡常數(shù)太低，可用增加底物濃度、偶聯(lián)反應(yīng)移去生成物、改變反應(yīng)pH 等方法,并

25、設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管一起到達(dá)平衡以后測(cè)定。 Km 在保證測(cè)定線性的前提下要盡量小。平衡法設(shè)計(jì)的要求酶法分析的設(shè)計(jì)要求(2).50酶的用量要足夠大，能使反應(yīng)1 min3 min 達(dá)到平衡，所用酶的 Km 應(yīng)足夠大，以保證測(cè)定線性和較長(zhǎng)的反應(yīng)動(dòng)態(tài)期。Km 太小，可加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑加大 Km。酶用量要合適，用少了可能導(dǎo)致線性期縮短，甚至一級(jí)反應(yīng)喪失。一般認(rèn)為酶用量比平衡法小。速率法酶促反應(yīng)受很多因素影響，只有很好控制反應(yīng)速度（v）才與代測(cè)物的濃度成正比例。速率法設(shè)計(jì)的要求酶法分析的設(shè)計(jì)要求(2).51所用酶的 Km 應(yīng)足夠大，以保證測(cè)定線性和較長(zhǎng)的反應(yīng)動(dòng)態(tài)期。區(qū)別速率法平衡法測(cè)定時(shí)間檢測(cè)速度檢測(cè)成本產(chǎn)物堆積樣品色原測(cè)定儀器較短較快酶用量小，成本低影響較小影響較小要求電噪聲小，A讀準(zhǔn)到0.000