植物細胞培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的制備 (2)課件

1、植物天然產(chǎn)物包括初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物初級代謝產(chǎn)物（Primary metabolites）： 是通過初級代謝產(chǎn)生的維持細胞生命活動必需的物質(zhì)，例如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。在不同種類的細胞中，初級代謝產(chǎn)物的種類基本相同。次級代謝產(chǎn)物（Secondary metabolites）： 是通過次級代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。由于次級代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。植物細胞培養(yǎng)途徑的優(yōu)點：減少耕地占用面積，且不受季節(jié)、地域的限制細胞培養(yǎng)是在無菌密閉的條件下進行的，可以排除病菌和害蟲的影響可以通過選擇優(yōu)

2、良細胞系和優(yōu)化培養(yǎng)條件的方法得到超過整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物通過改造生物合成途徑獲得新的有用物質(zhì)有價值的植物次級代謝產(chǎn)物:藥用代謝產(chǎn)物，如紫杉醇等。天然食品、食品添加劑，如胡蘿卜素、辣椒素等。殺蟲劑、殺菌劑，如農(nóng)藥噻吩烷、藍魚藤酮、粉紅魚藤酮等。飼料、精細化工等產(chǎn)品，如蠶養(yǎng)殖所需的專用植物等。1.從樹葉獲取細胞，利于資源保護（紅豆杉屬于瀕危保護植物）。2.細胞培養(yǎng)不受地理環(huán)境影響：地理環(huán)境、病蟲害和季節(jié)等因素的影響，可以保證產(chǎn)物無限、連續(xù)、均勻地生產(chǎn)。3.利用生物技術提高目標產(chǎn)物含量，實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)制備。（1）可以通過進行紅豆杉細胞的篩選，獲得超過原植株紫杉醇含量的細胞。（2）易于在生物反應器中

3、滿足最佳條件，進行大規(guī)模、高密度培養(yǎng)。（3）可以進行紅豆杉細胞紫杉醇代謝途徑研究，利用代謝調(diào)控使細胞定向合成有用次生代謝物。有效途徑：紅豆杉細胞培養(yǎng)制備紫杉醇（一）植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成聚酮途徑：聚酮類化合物。 莽草酸途徑：喹啉類、異喹啉類、吡咯啶類、烏頭類、吲哚類、大環(huán)類生物堿等。甲戊二羥酸途徑（甲瓦龍酸途徑）：萜 類、甾體。 理論上，所有的植物細胞都具有一個完整植株的全部遺傳信息，因此單個細胞也具有產(chǎn)生其親本植株所能產(chǎn)生的次生代謝的遺傳基礎。但是實際上，不同取材部位的細胞產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力是不同的，一些代謝產(chǎn)物積累與組織或器官的分化有關。因此細胞并不能像完整植株的某一部位一樣高效合成所

4、需的目的產(chǎn)物。因此，在進行植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價值的代謝產(chǎn)物時必須清楚產(chǎn)物的合成部位。在注意完整植株、植物的遺傳性狀的同時，還應該考慮到不同細胞的特性。要進行具有經(jīng)濟可行性的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)目標代謝產(chǎn)物，首先必須選出能夠比較高產(chǎn)量產(chǎn)生所需產(chǎn)物而且能夠快速生長的細胞株。1、細胞遺傳特性主要包括營養(yǎng)鹽、前體和調(diào)節(jié)因子、光照、溫度、攪拌與混合、通氣、PH等。（1）培養(yǎng)基、前體、調(diào)節(jié)因子培養(yǎng)基：一方面是保證植物細胞生物量的增長；另外一方面是要保證細胞能合成和積累次級代謝產(chǎn)物。普通的培養(yǎng)基一般僅能滿足第一方面的需要，對于第二方面的需求，必須針對具體的培養(yǎng)對象和目的，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，從而保證最大限度地積聚目標

5、產(chǎn)物。2、培養(yǎng)條件前體：指某一代謝中間體的前一階段的物質(zhì)。一般在生物合成反應的中間過程中，某一階段前的物質(zhì)，都可以說是該階段物質(zhì)的前體物質(zhì)。 缺乏某一種前體時細胞就不能合成某一種代謝物。如果在培養(yǎng)基中加入外源前體將會有助于合成該代謝產(chǎn)物或使其產(chǎn)量增加。誘導子促進次生產(chǎn)物積累與其種類和濃度有關誘導子對南方紅豆杉細胞培養(yǎng)合成紫杉醇的影響誘導子適宜濃度（mM）與對照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸鈰胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.0光照 光對細胞代謝產(chǎn)物的合成有很重要的影響。光照時間長短、光質(zhì)、光強等都會對代謝產(chǎn)物合成和積聚產(chǎn)生作用。光對許多酶有誘

6、導或抑制作用。如：黃酮及黃酮類醇糖苷累積的所有酶的活性的增加是在培養(yǎng)物受光照，特別是子外觀下發(fā)生的。pH PH會影響培養(yǎng)液的滲透壓、酸堿度，酶的活性，從而影響細胞代謝。 植物細胞液體培養(yǎng)的pH 變化范圍在56 之間，最佳的起始pH在5.55.8 之間。如果對培養(yǎng)液pH進行控制，將有利于次級代謝產(chǎn)物的生成。氣體 與微生物不同，植物細胞培養(yǎng)一般需要光照，通過光合作用合成有機物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對培養(yǎng)過程影響較大。 氧的傳遞與通氣速率、培養(yǎng)液混合程度、培養(yǎng)液流變特性、氣液界面面積等因素有關；而氧的吸收與反應器類型、細胞生長速率、溫度、pH、營養(yǎng)組成、細胞濃度等相關。通氣和攪拌引起的流體壓

7、力易造成細胞損傷、有益氣體的散失、大量泡沫的生成等，這些均會對細胞生長和產(chǎn)物積累產(chǎn)生影響；高密度引起培養(yǎng)液粘度增加，造成營養(yǎng)吸收、氣體傳遞的抑制；反應器結(jié)構(gòu)缺陷（如死角等）導致細胞粘附，引起細胞死亡，腐敗以及營養(yǎng)和氣體吸收限制等；對產(chǎn)物生物合成機制、途徑等不了解，因此很難維持最佳培養(yǎng)條件。3、放大過程中的影響因素培養(yǎng)設備：選擇或設計合適的生物反應器。培養(yǎng)工藝：誘導子添加、前體喂養(yǎng)、添加競爭途徑代謝產(chǎn)物抑制劑、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、環(huán)境條件）優(yōu)化與控制、流加培養(yǎng)。培養(yǎng)技術：固定化培養(yǎng)技術、兩相培養(yǎng)技術、兩步法培養(yǎng)（第1步細胞生長；第2步產(chǎn)物積累）。（三） 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑利用植物細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)為生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物提供了有效途徑，但是由于植物細胞容易積聚、細胞分化、剪切力敏感、代謝途徑復雜性等因素使工業(yè)規(guī)?；囵B(yǎng)受到限制。迄今為止，只有極少量的植物