第2節(jié)基因工程的基本操作程序課件

1、第2節(jié)基因工程的基本操作程序第2節(jié)基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用 載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。 才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)?；蚬こ袒静僮鞯乃膫€(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因：如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)

2、的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因：2獲取目1. 從基因文庫中獲取目的基因1. 基因文庫的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。2. 基因文庫的種類:基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫3.基因文庫的目的：為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。1. 從基因文庫中獲取目的基因1. 基因文庫

3、的概念:將含有某基因組DNA文庫與cDNA文庫某生物體內(nèi)全部DNA 許多DNA片段受體菌群體限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫cDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入cDNA文庫某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA基因組DNA文庫與cDNA文庫某生物體內(nèi)全部DNA 許多DN基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子啟動(dòng)子原核真核基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游的RNA聚合酶結(jié)合

4、位點(diǎn):基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子 外顯子 啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合 酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子)。與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子 外顯子 啟動(dòng)原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_的編碼區(qū)是間隔的、_的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具有調(diào)控作用的_區(qū)組成的編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非

5、編碼思考原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)基因文庫的構(gòu)建方法 基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因文庫的構(gòu)建方法 基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DN cDNA文庫的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法： 提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存 cDNA文庫的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法： 提取某種生物的某思考？真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？思考？真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的

6、真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動(dòng)子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較 文庫類型 cDNA文庫 基因組文庫 文庫大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段） 基因多少 物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較 文庫類型 2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目

7、的基因1概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng) 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。 2原理：DNA復(fù)制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：2原理：DNA復(fù)制多聚第2節(jié)基因工程的基本操作程序PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一

8、次，目的基因增加_倍一PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DPCR技術(shù)的操作過程PCR技術(shù)的操作過程PCR技術(shù)的操作過程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴(kuò)增PCR技術(shù)的操作過程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶

9、、解旋酶等PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理3. 人工合成法 在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？3. 人工合成法 在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利人工合成法（真核生物）反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測(cè)推測(cè)單鏈DNA合成人工合成法（真核生物）反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化課堂小結(jié)目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用

10、PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫課堂小結(jié)目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心1目的：2基因表達(dá)表達(dá)載體啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的

11、一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來表達(dá)載體啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是R基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口DNA注意：載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵

12、都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意：載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部 三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。 三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化：2常用的受體細(xì)胞：3目的1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植 物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。 原理：Ti質(zhì)粒

13、上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)過程：三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞 操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力 ，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。 鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um 。 適用：單子葉植物1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（2）基因槍法：目的基因?qū)雴?、目的基因

14、導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞 特點(diǎn):十分簡便經(jīng)濟(jì)。 例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（3）花粉管通道法：將目的基因2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法程序目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法程序目的基因表3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞過程：C

15、a2+處理大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物作受體細(xì)胞原因：Ca2+小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的DNA表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì) 四、目的基因的檢測(cè)與

16、鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝 入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？ 不一定，需要檢測(cè) 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝1、鑒定分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法DNA分子雜交技術(shù)變性變性1、鑒定分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生探針15N15N14N141、鑒定分子水平的鑒定變性方法分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N

17、14N1、鑒定分子水平的鑒定變性方法分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)1、鑒定分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì) 出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)1、鑒定分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋2、鑒定個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。2、鑒定個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)思考？不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，

18、才能說明目的基因完成了表達(dá)。受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？思考？不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是( ) A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來 B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是( )A課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成 A. B. C. D.D課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )D課堂練習(xí)3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合