無(wú)菌檢查和微生物限度檢查陽(yáng)性菌種的管理

1、無(wú)菌檢查和微生物限度檢查陽(yáng)性菌種的管理一、實(shí)驗(yàn)室要求：實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)清潔、衛(wèi)生、安靜，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙和飲食。實(shí)驗(yàn)人員必須穿戴工作衣帽，工作服經(jīng)常洗滌、消毒、保持清潔。操作前后或離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室必須用肥皂或消毒液洗手。發(fā)生菌液污染臺(tái)面或地面，應(yīng)立即用甲醛或碳酸等消毒液由外向內(nèi)傾覆其上，小時(shí)后再擦拭，如為破傷風(fēng)梭菌，則應(yīng)隔夜后再擦洗。工作衣、帽、口罩受到菌液污染時(shí)，應(yīng)立即脫下使污染部位包裹在內(nèi)部，高壓滅菌后再清洗。如有傳染性培養(yǎng)物污染手部，應(yīng)先用乙醇棉球擦拭，再浸入新潔爾滅消毒液內(nèi)泡手，然后再用肥皂及清水徹底洗干凈。接種環(huán)針）每次使用前后，必須通過(guò)火焰滅菌，冷卻后方可接種培養(yǎng)物，接種帶有蠟質(zhì)、油質(zhì)的培養(yǎng)

2、物或菌苔殘留多時(shí)，不應(yīng)立即在火焰上灼燒，應(yīng)先在內(nèi)焰里將油質(zhì)培養(yǎng)物烘干后再移至火焰上滅菌，以免活菌外濺污染環(huán)境及感染操作者。帶菌的吸管應(yīng)浸泡在甲酚消毒液內(nèi)后取出清洗，帶菌的試管或培養(yǎng)物應(yīng)在高壓滅菌后再取出清洗。在接種霉菌、放線(xiàn)菌時(shí)應(yīng)在鋪有浸過(guò)消毒液的紗布上操作，防止孢子散落傳播。凡帶活菌的物品，必須消毒后才能清洗，嚴(yán)禁污染下水道。二、無(wú)菌操作要求無(wú)菌操作是指在無(wú)菌的環(huán)境條件下，使用無(wú)菌器材，防止微生物污染的操作技術(shù)。即保持待檢樣品在操作時(shí)不被污染，又要防止被檢的微生物及陽(yáng)性對(duì)照菌在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。從事無(wú)菌及微生物操作的工作人員必須經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)及基礎(chǔ)微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)知識(shí)的學(xué)習(xí)及培訓(xùn)才具備

3、上崗操作的資格，微生物專(zhuān)業(yè)檢驗(yàn)人員也不應(yīng)該頻繁地變換工作崗位。無(wú)菌室應(yīng)每次使用前后用新潔爾滅消毒液或甲醛液擦拭工作臺(tái)面及可能污染的死角，濕拖地面，打開(kāi)無(wú)菌空氣過(guò)濾器及超凈工作臺(tái)的開(kāi)關(guān)分鐘，紫外線(xiàn)殺菌燈照射小時(shí)。操作人員用肥皂洗手后進(jìn)入緩沖間換拖鞋，用乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。將所需物品剝?nèi)ヅＦぜ埣巴獍b，從傳遞窗移入操作間，再用新潔爾滅泡手后進(jìn)入操作間，在乙醇或煤氣燈火焰區(qū)火焰高度操作。供試品表面消毒，如為安瓿先用砂輪劃痕后用碘酒棉球擦拭，再用乙醇棉球擦拭、待干，也可以用消毒液浸泡消毒。操作者勿用嘴直接吸吹吸管，防止致病菌感染操作人員及口中的雜菌污染供試品。在無(wú)菌操作中切勿大幅度或快速

4、動(dòng)作、拖行，以免攪動(dòng)空氣中塵埃微粒。注射器如需回抽時(shí)，應(yīng)對(duì)著火焰吸入無(wú)菌空氣。所用的器材如培養(yǎng)基、稀釋劑配制后經(jīng)濕熱滅菌分鐘，吸管培養(yǎng)皿等均應(yīng)洗滌，干燥，包扎后經(jīng)干熱滅菌小時(shí)才能使用。三、儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室所用的各種儀器，如培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴瓶、電熱恒溫干燥箱等，均應(yīng)嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)操作，均應(yīng)按計(jì)量要求定期檢測(cè)，并做好檢測(cè)與維修記錄，以保證其正常使用。無(wú)菌操作凈化工作臺(tái)要定期檢測(cè)潔凈度，應(yīng)達(dá)到百級(jí)。凈化工作臺(tái)的高效過(guò)濾器應(yīng)根據(jù)使用情況四、培養(yǎng)基的管理培養(yǎng)基是人工配制的適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基的管理在無(wú)菌及微生物限度檢查工作中起著重要的作用。培養(yǎng)基購(gòu)入后應(yīng)記錄名稱(chēng)、產(chǎn)地、批號(hào)，培養(yǎng)

5、基配制記錄應(yīng)包括名稱(chēng)、配制量、配制者、配制日期。干燥培養(yǎng)基的配制應(yīng)先量入蒸餾水至容器中，再稱(chēng)取培養(yǎng)基干粉放入水中，搖勻，靜置分鐘使其溶解，一般不要加熱，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。培養(yǎng)基配制后應(yīng)立即滅菌，以防長(zhǎng)菌使?fàn)I養(yǎng)成分損耗，高壓滅菌時(shí)應(yīng)防止溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使?fàn)I養(yǎng)成分破壞致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。滅菌時(shí)間稀釋劑滅菌分鐘，含糖培養(yǎng)基滅菌分鐘。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在涼暗處或置冰箱內(nèi)保存，一月左右使用。保存時(shí)間需視培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)程度及有無(wú)污染而定，用硅膠塞，封入塑料袋，內(nèi)可延長(zhǎng)保存時(shí)間。培養(yǎng)基切勿反復(fù)加熱使用。培養(yǎng)基的質(zhì)量控制，應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)的蛋白胨，牛肉膏等營(yíng)養(yǎng)成分，化學(xué)純以上的化學(xué)試劑，調(diào)配成最適

6、的值。配制后應(yīng)按規(guī)定做無(wú)菌試驗(yàn)，如無(wú)菌檢查用的培養(yǎng)基，需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基置培養(yǎng)小時(shí)，真菌培養(yǎng)基置培養(yǎng)小時(shí)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。除此以外，還需做培養(yǎng)基性能的質(zhì)量控制，性能試驗(yàn)即不同的培養(yǎng)基接種不同的已知標(biāo)準(zhǔn)菌株，培養(yǎng)小時(shí)后，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，如無(wú)菌檢查培養(yǎng)基需做培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)，細(xì)菌生長(zhǎng)良好，說(shuō)明培養(yǎng)基性能可靠。五、實(shí)驗(yàn)菌種的保藏與管理國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種菌號(hào)是、C代表細(xì)菌，代表真菌。由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。菌種保藏基本要求菌種的保藏是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，用人工方法低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)等方法控制微生物的代謝，使細(xì)胞基本上處于休眠狀態(tài)，繁殖受到抑制仍保持菌種原有的各種生物

7、學(xué)特性，以達(dá)到保種的目的。菌種保藏的關(guān)鍵是不變異、不污染、不死亡。菌種保藏分四個(gè)階段挑選特征典型的純菌菌落，其方法是用接種環(huán)挑取少許菌苔，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯或氯化鈉溶液中制成菌液，再取一環(huán)菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線(xiàn)，培養(yǎng)后可見(jiàn)單個(gè)菌落生長(zhǎng)。凡能產(chǎn)生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進(jìn)行保種孢子和芽胞的代謝作用較弱，但對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗。在傳代前，將菌液管放入水浴中作用分鐘，殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退，檢查項(xiàng)目菌落形態(tài)、染色、鏡檢、生化特性及血清學(xué)檢查。選擇適宜的培養(yǎng)基及方法常用菌種的保藏方法普通瓊脂斜面用于常用細(xì)菌的傳代。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

8、內(nèi)按加入瓊脂粉配制而成。接種培養(yǎng)后，將菌種管用硅膠塞塞緊，置冰箱保存，每隔個(gè)月傳種一次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，菌種可放5培養(yǎng)箱內(nèi)保存。半固體瓊脂用于常用細(xì)菌的傳代。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)按加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養(yǎng)后，置冰箱保存，個(gè)月傳種一次。如在培養(yǎng)管內(nèi)加少量無(wú)菌液體石蠟隔絕空氣，減少水分蒸發(fā)，可延長(zhǎng)菌種保藏期。真菌瓊脂斜面用于真菌的傳代。在真菌培養(yǎng)基內(nèi)按加入瓊脂粉配制而成。劃線(xiàn)接種后，培養(yǎng)小時(shí)，置冰箱保存，個(gè)月傳種一次。沙氏瓊脂斜面用于真菌的傳代。配方蛋白胨，葡萄糖0瓊脂粉3水0待l述成分溶化后，搖勻分裝，滅菌分鐘，趁熱擺成斜面。培養(yǎng)、保存及傳代同甘油水用于細(xì)菌的傳代

9、。配制方法甘油加水至即成。分裝至試管內(nèi)，每支左右，滅菌分鐘備用。接種細(xì)菌后直接放冰箱保存，個(gè)月傳代一次。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌菌液至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)€月傳種一次。皰肉培養(yǎng)基用于破傷風(fēng)梭菌的傳代。取破傷風(fēng)梭菌菌液接種于皰肉培養(yǎng)基內(nèi)，6土厭氧培養(yǎng)天，置冰箱保存，個(gè)月傳代一次。液氮超低溫保藏法適用于各類(lèi)微生物的保藏。液氮溫度可達(dá),此時(shí)菌種的新陳代謝活動(dòng)已停止，但不會(huì)死亡。在配制好的菌液內(nèi)加甘油作為保護(hù)劑，分裝于安瓿中，置液氮罐內(nèi)可保存年之久。冷凍真空干燥保藏法本法廣泛適用于各類(lèi)微生物的保藏，包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護(hù)作用的介質(zhì)內(nèi)，分裝于滅

10、菌菌種管內(nèi)，速凍后抽真空，使菌液很快變?yōu)槭杷傻母稍锞?，最后在真空狀態(tài)下密封管口，菌種保存期最長(zhǎng)可達(dá)年以上。菌種檢查與復(fù)壯菌種在傳代保藏過(guò)程中，易發(fā)生衰退、變異、污染、死亡，因此必須定期檢查。將菌種接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)使之復(fù)活，重新分離，純化開(kāi)成單個(gè)菌落，再作菌種檢定，包括菌落形態(tài)、顏色，染色性、鏡下觀(guān)察菌體形態(tài)等，必要時(shí)可做生化試驗(yàn)及血清學(xué)反應(yīng)。菌種經(jīng)人工傳代保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變而引起特性變?nèi)趸蛳鶠榫N衰退。使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性，稱(chēng)為菌種復(fù)壯。常用方法有分離純化將菌種接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)小時(shí)，取菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線(xiàn)，培養(yǎng)后挑取典型單個(gè)菌落。宿主復(fù)壯將退化菌種

11、接種到相應(yīng)昆蟲(chóng)或動(dòng)植物宿主體內(nèi)，傳種數(shù)代可恢復(fù)其原有的特性與毒力。通過(guò)極端的逆境處理使那些退化的細(xì)菌死亡，選育健壯的傳代保種。實(shí)驗(yàn)菌種的管理用菌毒種應(yīng)放入專(zhuān)用冰箱帶鎖）專(zhuān)人保管，菌種應(yīng)有購(gòu)入記錄，傳代記錄，使用銷(xiāo)毀記錄。菌種應(yīng)定期檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退。為了保持菌種原有的各種生物學(xué)特性保證實(shí)驗(yàn)菌種的質(zhì)量，近年來(lái)國(guó)外提出了使用菌種不超過(guò)五代的要求。雖然目前我國(guó)藥典對(duì)于菌種的傳代次數(shù)未做要求，我們實(shí)驗(yàn)中所用的陽(yáng)性對(duì)照菌可能已經(jīng)傳了無(wú)數(shù)代，存在著菌種衰退、老化變異、不敏感等隱患，對(duì)于使用菌種不超過(guò)五代給我們提出了更高的要求。我們可以用以下方式傳代凍干菌種T營(yíng)養(yǎng)肉湯T半固體瓊脂或甘油水支冰箱保存原代一代二代菌種的保藏條件及傳種時(shí)間菌種名稱(chēng)培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間保存溫度傳種時(shí)間金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基個(gè)月。藤黃微球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，4,個(gè)月。生孢梭菌