金克對乳腺癌裸鼠移植瘤模型生長轉(zhuǎn)移和凋亡的影響

1、金克對乳腺癌裸鼠移植瘤模型生長轉(zhuǎn)移和凋亡的影響【摘要】目的觀察金克槐耳清膏對人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法以F?鄄7細(xì)胞復(fù)制裸鼠異種乳腺癌移植瘤模型，30只BALB/荷瘤鼠隨機(jī)分為對照組15只、金克組15只。分別用生理鹽水0.2l/只和金克(0.2l/只)連續(xù)灌胃30d，觀察各組的抑瘤效果及對裸鼠瘤體大小和生存時間的影響。采用光鏡、Tunel法行原位凋亡檢測、流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤凋亡的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果金克組腫瘤體積大小明顯小于對照組4.621.863，6.352.733，P0.01；金克組生存期為明顯長于對照組116.728.5d，95.326.7d，P0.01

2、；原位凋亡檢測移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)AI明顯金克組高于對照組，差異有顯著性19.32%vs8.36%，P0.01；流式細(xì)胞術(shù)顯示金克組凋亡比例與對照組差異有顯著性18.21%vs8.39%，P0.01。結(jié)論金克可抑制人乳腺癌細(xì)胞F?鄄7移植瘤生長，延長生存期?！娟P(guān)鍵詞】金克乳腺腫瘤移植瘤凋亡金克槐耳顆粒具有良好的促凋亡效果和免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用，無明顯毒副作用。對肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有獨(dú)特療效1。本文主要觀察金克對乳腺腫瘤生長的抑制作用，對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。1材料與方法11材料金克槐耳清膏由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)提供。人乳腺癌細(xì)胞株F?鄄7購于上海生命科學(xué)院。細(xì)胞培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)液中，呈貼壁生長

3、。培養(yǎng)細(xì)胞置于37、52培養(yǎng)箱中，每35天傳代1次。實(shí)驗動物：安康雌性純種裸鼠，46周齡，體重12g20g，購自湖北省實(shí)驗動物研究中心合格證號：SXK(鄂)2022?鄄0005，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心。裸鼠置于恒溫層流箱中，于無特定病原體SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，12h光照和12h黑夜交替。喂養(yǎng)符合衛(wèi)生部公布的“醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物全價營養(yǎng)飼料標(biāo)準(zhǔn)。12方法人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的建立：人乳腺癌細(xì)胞株F?鄄7在含10的胎牛血清及160U/L胰島素的RPI?鄄1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增，搜集對數(shù)生長期細(xì)胞制備懸液，活細(xì)胞濃度為1107/l。臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞占95以上。SPF環(huán)境下進(jìn)展實(shí)

4、驗操作，在每只裸鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液0.1l/只含細(xì)胞數(shù)約0.5107個2,3。動物分組及用藥：接種4周后，將裸鼠隨機(jī)分為對照組和金克組。對照組：15只，采用灌胃法給藥，每天灌注0.9生理鹽水0.2l/只，共30d。金克組15只，每天灌注藥物0.2l/只，其濃度為150g/l，共30d。金克組藥物劑量相當(dāng)于人體正常服用金克劑量根據(jù)體外表積比值進(jìn)展換算折合成裸鼠的劑量4。移植瘤生長情況及藥物抑瘤效果：給藥后每隔3d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大長徑a、橫徑b。計算移植瘤的體積ab2/25，繪制移植瘤生長曲線。移植瘤組織病理學(xué)觀察：取移植瘤用4多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。裸

5、鼠主要臟器組織學(xué)觀察：將裸鼠的肝、肺固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察有無臟器轉(zhuǎn)移。生存期觀察：待各組裸鼠衰竭時處死或自然死亡，記錄死亡時間，按公式計算生命延長率：生命延長率金克組平均存活時間對照組平均存活時間/對照組平均存活時間100。凋亡指數(shù)AI：原位凋亡檢測Tunel法熒光顯微鏡下初步分析，光鏡下避開壞死區(qū)，選10個高倍視野400倍凋亡典型區(qū)域，計數(shù)1000個細(xì)胞，其中陽性細(xì)胞數(shù)百分比即為AI。流式細(xì)胞術(shù)：待裸鼠衰竭時處死或自然死亡，剝?nèi)∧[塊，用剪刀取局部瘤塊，將瘤組織剪碎，并用0.1PBS液反復(fù)沖洗，用200目金屬網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液，離心后去掉上清液，再參加0.1PBS液沖洗，

6、再離心，去掉上清液，參加70乙醇1l，邊加邊振蕩。然后上流式細(xì)胞儀FASanBetnDikinsn，美國，做細(xì)胞周期采樣分析，檢測各組細(xì)胞凋亡比例及主要作用細(xì)胞分裂的哪個周期。1.3統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果21裸鼠移植瘤生長情況30只裸鼠皮下接種F?鄄7細(xì)胞懸液10d左右，于接種部位皮下均可觸及直徑約23的瘤塊，致瘤率100。其后腫瘤逐漸長大，28d后移植瘤長徑長至0.8左右，再分組給予不同的藥物處理，此后每3d檢測1次移植瘤最大長徑和橫徑，計算移植瘤體積，裸鼠治療第30d移植瘤平均體積對照組為6.352.733；金

7、克組為4.621.863，差異有顯著性P0.01。顯示金克對移植瘤生長有明顯的抑制作用。22移植瘤組織病理學(xué)變化肉眼觀察，腫瘤呈圓形、橢圓形或分葉狀包塊，質(zhì)地硬，切面呈灰白色。大局部與周圍組織分界清楚。對照組中可見4只有胸壁浸潤。光鏡下對照組移植瘤細(xì)胞仍保持培養(yǎng)狀態(tài)下癌細(xì)胞原有的異型性，形狀不規(guī)那么，大小不一，核大濃染，核異型明顯，可見病理性核分裂相，核質(zhì)比例明顯增大，可見少量組織壞死區(qū)；金克組腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度退行性變，局部腫瘤組織出現(xiàn)明顯壞死。提示金克組可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞壞死。23裸鼠生活狀況及主要臟器組織學(xué)檢查對照組裸鼠較金克組消瘦明顯，在光鏡下對其肝、肺臟器組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)3只肝部有結(jié)

8、節(jié)形成，病理證實(shí)為移植瘤肝轉(zhuǎn)移；金克組狀態(tài)良好，光鏡下對其肝、肺臟器組織學(xué)觀察未見有病理學(xué)改變，提示用藥可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。24兩組裸鼠生存期觀察待裸鼠飼養(yǎng)至衰竭時處死或自然死亡，記錄死亡時間對照組平均存活時間為95.326.7d；金克組平均存活時間為116.728.5d，生命延長率為22，金克組與對照組比擬差異有顯著性P0.01。25兩組癌細(xì)胞凋亡觀察原位凋亡檢測Tunel法檢測，光鏡下見凋亡細(xì)胞核染成棕黃色，金克組AI為19.32%，而對照組AI為8.36%。金克組凋亡指數(shù)明顯高于對照組P0.01，提示金克可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡見圖1。26流式細(xì)胞檢測流式細(xì)胞檢測分析結(jié)果顯示，對照組凋亡比

9、例為8.39%，而金克組凋亡比例為18.21%，差異顯著性P0.01，并且金克組的G0/G1期分布高于對照組，提示金克可使細(xì)胞停滯于G1期，限制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。3討論金克槐耳清膏其主要活性成分是多糖蛋白PST。對肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有獨(dú)特療效611。前期研究顯示，金克具有在體外抑制乳腺癌F?鄄7細(xì)胞生長的作用。我們通過復(fù)制人乳腺癌細(xì)胞株F?鄄7裸鼠移植瘤，進(jìn)一步觀察金克抗癌作用。由于裸鼠無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常上皮，且這種上皮不能使T細(xì)胞正常分化，因此裸鼠缺乏成熟的T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞活性亦很低12，因此我們通過選取裸鼠為實(shí)驗材料，可以排除機(jī)

10、體免疫調(diào)節(jié)作用對腫瘤的影響，更好地討論金克對腫瘤的直接作用。結(jié)果顯示金克在體內(nèi)具有明顯抑制腫瘤生長的作用。盡管F?鄄7細(xì)胞株不是高侵襲性的細(xì)胞株，但我們?nèi)匀挥^察到對照組4只裸鼠有胸壁浸潤，并有3只發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，而金克組未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，反映金克對乳腺癌的浸潤生長和轉(zhuǎn)移發(fā)生有抑制作用。腫瘤不僅是增殖、分化異常的疾病，更是凋亡異常的疾病13，14，調(diào)控細(xì)胞凋亡成為目前腫瘤治療研究的一個新熱點(diǎn)15。關(guān)于細(xì)胞凋亡的檢測手段較多，目前認(rèn)為Tunel法結(jié)合了組織化學(xué)的方法，定位準(zhǔn)確，特異性與敏感性高，假陽性低，可更準(zhǔn)確地反映凋亡發(fā)生的程度16。本實(shí)驗應(yīng)用Tunel法可見到金克組有典型的凋亡細(xì)胞、凋亡小體

11、或出泡現(xiàn)象，凋亡指數(shù)顯著高于對照組，說明金克可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤生長。用流式細(xì)胞儀分析兩組細(xì)胞周期的結(jié)果顯示金克組的G0/G1期分布高于對照組，說明金克主要作用于G1/S節(jié)點(diǎn)，使細(xì)胞停滯于G1期，限制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述，金克具有誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移發(fā)生，延長生存期的作用。但是由于中藥的成分復(fù)雜，金克的相關(guān)作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的研究和討論?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1莊毅.真菌抗癌藥物槐耳顆粒的研制J.中國腫瘤,1998,8(12):540-543.2KyriazisAP,DiPL,ihaelGJ,etal.Grthpatternsandeta

12、statibehavirfhuantursgringinathyiieJ.anerResearh,1978,38(10):3186-3190.3田慶鍔,李瑪琳.人腫瘤細(xì)胞懸液裸鼠皮下接種及影響移植成功的因素J.實(shí)驗動物科學(xué)與管理,2022,21(3):47-50.4vejevaAA,HuhensDP,BarkerAD.hetherapyfhuanturxengraftsingenetiallyathyiieJ.AnnlinLabSi,1978,8(1):50-56.5賀石林,陳修.醫(yī)學(xué)科研方法導(dǎo)論.北京：人民衛(wèi)生出版社,1998.5056.6周啟康.金克、噻替派和絲裂霉素膀胱癌術(shù)后運(yùn)用J.浙江

13、腫瘤,1998,49(4):249-250.7姚亞民,馬智勇,趙艷秋.金克在原發(fā)性肝癌治療中的應(yīng)用J.中國腫瘤,2000,9(8):封三.8姚亞民,馬智勇,趙艷秋.金克沖劑合并化療治療非小細(xì)胞肺癌41例J.中國腫瘤,2001,10(3):184-185.9張鈴,韓風(fēng),馬洪波.金克在原發(fā)性肝癌治療中的應(yīng)用J.中國腫瘤,2000,9(8):封三.10劉星野,周默巍,徐楓等.金克槐耳顆粒配合FA治療晚期胃癌38例J.浙江腫瘤,1999,5(3):189.11NakazatH,KikeA,SajiS,etal.Effiayfiunhetherapyasadjuvanttreatentafterurat

14、iveresetinfgastrianer.StudyGrupfIunhetherapyithPSKfrGastrianerJ.Lanet,1994,343(8906):1122-1126.12陳主初,吳端生.實(shí)驗動物學(xué).第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2000.232233.13Nura,atariJ,YktaK,etal.rphgenesisfnnplypidlretaladenasandearlyarinasassessedbyellprliferatinandapptsisJ.VirhsArh,2000,437(1):17-24.14ullauerL,GruberP,SebingerD,etal.utatinsinapptsisgenes:apathgenetifatrfrhuandiseaseJ.utatRes,2001,4