結(jié)腸癌腫瘤自身抗體譜篩選及其應(yīng)用

1、結(jié)腸癌腫瘤自身抗體譜挑選及其應(yīng)用結(jié)腸癌是在歐美國家發(fā)病率位居第二的癌癥，在我國結(jié)腸癌的發(fā)病率目前排第五位。近年來，其發(fā)病率還在逐年上升。目前早期結(jié)腸癌的診斷率仍很低，約1/4的患者在初次確診時已有遠處轉(zhuǎn)移，其中50%是肝轉(zhuǎn)移。最新的腫瘤免疫學(xué)研究認(rèn)為，病人可對自身腫瘤抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答1。正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，突變的基因或各種異常表達的蛋白可以成為腫瘤抗原誘導(dǎo)機體的免疫反響，在腫瘤患者血清中可以檢測到腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體譜2。進一步的研究發(fā)如今腫瘤患者和正常人的血清中腫瘤自身抗體譜存在顯著差異3，提示自身抗體譜有可能作為腫瘤早期診斷的新型血清標(biāo)志物?；谶@個理論，我們構(gòu)建患者結(jié)腸癌組

2、織的dna表達文庫，挑選了結(jié)腸癌相關(guān)自身抗體譜，并討論將其作為結(jié)腸癌早診的血清學(xué)標(biāo)志物的可能。1資料和方法1.1資料結(jié)腸癌組織來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院收治的1例男性結(jié)腸癌患者，病理診斷為低分化型腺癌，肝多發(fā)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6/18，為本院腹部外科手術(shù)切除，手術(shù)同時取該病人血清。其他30例結(jié)腸癌術(shù)前病人血清來自本院檢驗科。手術(shù)獲取的癌組織和患者血清及30例安康正常自愿者的血清采集后立即凍于-80備用。1.2方法nbigenbakdatabase中進展分析，主要包括核苷酸序列同源性分析、讀碼框分析等。1.3統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計各個陽性克隆在正常人及結(jié)腸癌病人血清中的抗體陽性率，用2檢驗進展統(tǒng)計學(xué)處理。

3、2結(jié)果2.1構(gòu)建庫容為5105pfu的人結(jié)腸癌dna表達文庫共提取rna10g,d260d280值為2.05,說明其純度較高，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示其為從9.40.5kb的彌散，主要集中于1.52.0kb左右，說明提取的rna質(zhì)量較好，沒有明顯的降解。以提取的5g結(jié)腸癌組織rna為模板，在合成dna第一鏈和第二鏈的同時隨機摻入32p。電泳后放射自顯影顯示，第一鏈為介于9.00.5kb的彌散，大部分集中于1.52.0kb左右,無明顯的條帶；dna第二鏈的范圍比第一鏈稍大，為介于10.00.5kb的彌散，大部分集中于1.52.0kb左右，也無明顯的條帶。結(jié)果說明，利用高溫反轉(zhuǎn)錄酶成功地對rna進展

4、了反轉(zhuǎn)錄，合成的dna第一鏈涵蓋了絕大多數(shù)的rna分子，造成隨后合成的第二鏈同樣涵蓋了絕大多數(shù)的rna分子。取100ngdna與zapexpress載體連接后，用gigapakgldlningkit提供的包裝蛋白進展包裝。獲得庫容為5105pfu的結(jié)腸癌組織dna表達原始文庫。文庫不經(jīng)擴增直接用于抗原篩眩2.2從結(jié)腸癌組織dna表達文庫中挑選出了33個與患者血清反響的克隆a：第一輪挑選；b：第二輪篩眩實心箭頭所示為第一、二輪挑選的陽性克隆，空心箭頭為在第一輪挑選中呈陽性而在第二輪挑選中呈陰性的克隆圖1文庫血清學(xué)挑選得到的陽性克隆2.3同源性分析陽性克隆基因代表29個不同基因?qū)Λ@得的33個陽性克

5、隆首先進展內(nèi)部剪切。用eri和xhi雙酶切鑒定外源插入片段的大校其中31個陽性克隆剪切成功，片段大小在0.52.0kb之間。將這些克隆進展核苷酸序列測定。核苷酸序列顯示31個克隆代表不同的抗原分子。進入genbank進展est同源性比較發(fā)現(xiàn)，有29個克隆與genbank已有的est具有較高的同源性，如表1所示。余下2個克隆的序列與genbank已報道的est或基因的外顯子序列無明顯同源。表1部分結(jié)腸癌dna表達文庫的陽性克隆的同源性分析2.4陽性克隆與正常人血清反響性明顯低于結(jié)腸癌患者我們檢測了4個陽性克隆與30例結(jié)腸癌患者血清和30例正常人血清的反響情況。圖2是1克隆與5例結(jié)腸癌和5例正常人

6、血清的反響情況。1克隆與腫瘤患者的血清反響明顯強于正常人血清。1、29、21克隆在正常人血清中抗體陽性率較低，均小于23%，而在結(jié)腸癌病人血清中抗體陽性率較高均大于77%，見表2，2檢驗結(jié)果顯示有顯著性差異p0.01，提示其有可能成為結(jié)腸癌早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志物。14與正常人和結(jié)腸癌患者血清的反響性相似。以1、29、21三個克隆中任意一個陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，那么對上述30例癌和30例正常的診斷特異性和敏感性分別達90%和70%。假如以1、29、21三個克隆中任意兩個陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，那么對上述30例癌和30例正常的診斷特異性和敏感性分別達80%和100%。a：腫瘤血清；b：正常血清圖21克隆與5例結(jié)

7、腸癌陽性反響和與5例正常人血清陰性反響表21、29、21、14與正常人及結(jié)腸癌病人血清反響的陽性率克隆號正常血清陽性率病人血清陽性率卡方檢驗123%(7/30)76%(23/30)p0.01296%(2/30)80%(24/30)p0.01210%(0/30)77%(23/30)p0.011466%(20/30)73%(22/30)p0.053討論本研究采用serex技術(shù)對結(jié)腸癌腫瘤自身抗體譜進展了研究，獲得了31例陽性克隆，代表了31種結(jié)腸癌腫瘤自身抗體。其中有兩個克隆與的est和人的dna外顯子序列無明顯同源，有報道這些序列表達的肽段可能是模擬了某些抗原分子的表位而被腫瘤自身抗體所識別8。

8、其余29例陽性克隆包括人線粒體基因，自身抗原，分子伴侶，dna修復(fù)酶，細(xì)胞膜外表蛋白，核糖體蛋白及一些目前功能尚未確定的基因等，其中既有發(fā)生了點突變及缺失的基因，也有未發(fā)生突變的基因。比方，3是人跨膜蛋白酪氨酸激酶同源蛋白,i型糖尿病自身抗原，屬于癌癥非依賴性自身抗原。4、22、21、23、27均為人線粒體基因組片段，8、15均為核糖體蛋白，應(yīng)屬于癌癥相關(guān)自身抗原，其在正常組織及腫瘤組織均有表達，在腫瘤壞死時被暴露出來，從而被免疫系統(tǒng)所識別，發(fā)生體液免疫應(yīng)答。其中1，尿嘧啶dna糖基化酶，主要參與dna復(fù)制時錯配的修復(fù)；14人apex核酸酶(多功能dna修復(fù)酶)基因；二者都參與dna的復(fù)制及修

9、復(fù)。這些抗原基因是通過何種機制誘發(fā)腫瘤患者產(chǎn)生自身抗體，它們又是如何參與結(jié)腸癌的發(fā)生開展的呢？這仍需一步的研究。腫瘤自身抗體譜作為腫瘤血清診斷的新型標(biāo)志物的應(yīng)用前景和價值已逐漸被學(xué)界認(rèn)可，這一領(lǐng)域的研究已逐漸成為腫瘤血清診斷的新型標(biāo)志物研究的熱點。2022年，ang等8報道他們通過類似的方法得到的22個前列腺癌抗原對于前列腺癌的診斷的敏感性到達了81.6%，特異性到達了88.2%，明顯高于psa診斷的結(jié)果。他們的這一研究被新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志評為近年來分子診斷標(biāo)志物的最重要的進展9。2022年的一項最新研究報道也顯示，蛋白芯片檢測自身抗體譜技術(shù)可以提早于臨床診斷5年發(fā)現(xiàn)約80%的處于“癌前階段的患者，證明該技術(shù)在癌前病變的篩查中也具有非常重要的作用10。本研究對新發(fā)現(xiàn)4個結(jié)腸癌自身抗體作為結(jié)腸癌血清標(biāo)志物的潛能進展了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1、29、21在正常人血清中抗體陽性率較低，均小于23%，而在結(jié)腸癌病人血清中抗體陽性率較高，均大于77%,2檢驗結(jié)果顯示有顯著性差異p0.01。應(yīng)用多個分子標(biāo)志物結(jié)合診斷腫瘤已經(jīng)成為學(xué)界共識。我們應(yīng)用這三個標(biāo)志物結(jié)合分析也明顯地進步了診斷的敏感性和特異性，說明其可以成為結(jié)腸癌早期診斷的血清學(xué)標(biāo)