HPLC-DAD測(cè)定5種苯類化合物實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、HPLC-DAD測(cè)定 5 種苯類化合物（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）環(huán)境工程 劉鵬 123351一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?2基本了解高效液相色譜（1200LC）組成結(jié)構(gòu)，硬件操作及掌握化學(xué)工作站的開機(jī)，關(guān)機(jī)，參數(shù)設(shè)定，數(shù)據(jù)采集及分析的基本操作。34掌握高效液相色譜定性、外標(biāo)定量方法。二、實(shí)驗(yàn)原理分配色譜原理：主要基于樣品分子在流動(dòng)相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。C18 柱反相 HPLC（reversed phase HPLC其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物質(zhì)的分離。diode-ar

2、ray detector, ）工作原理：以光電二極管陣列（或CCD 陣列，硅靶攝像管等）作為檢測(cè)元件的 UV-VIS 檢測(cè)器，它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測(cè)器不同的是，普通 UV-VIS檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長(zhǎng)的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列 UV-VIS 檢測(cè)器是先讓所有波長(zhǎng)的光都通過流動(dòng)池，然Agilent 1200 DAD 全掃描波長(zhǎng)范圍為190nm-950nm ）Agilent 1200 LC 液相色譜儀的工作過程：輸液泵將流動(dòng)相

3、以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在進(jìn)入色譜柱之前通過自動(dòng)進(jìn)樣器將樣品導(dǎo)入，流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分因處理或保存。外標(biāo)法定量：外標(biāo)法是色譜分析中一種簡(jiǎn)便的定量方法。當(dāng)樣品中所有組分都得到良好的分離并都能被檢測(cè)而得到色譜峰時(shí)，則可利用外標(biāo)法定量計(jì)算樣品中各組分的濃度。其定量的依據(jù)是被測(cè)物質(zhì)的量與它在色譜圖上的峰面積（或峰高）成正比。數(shù)據(jù)處理軟件（工作站）可以給出包括峰高和峰面積在內(nèi)的多種色譜數(shù)據(jù)。一般由被測(cè)物所配標(biāo)準(zhǔn)濃度與峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測(cè)物濃度。三、儀器及試劑1、儀器：Agilent 1200 HPLC（四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、 DAD檢測(cè)器、C18色

4、譜柱，穩(wěn)壓電源。2、試劑： 色譜級(jí)乙腈、甲醇；Miniport超純水；含5個(gè)苯類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品；實(shí)際測(cè)試水樣四、實(shí)驗(yàn)方法1.進(jìn)樣器洗針進(jìn)樣2.設(shè)置泵進(jìn)樣量 20.0L流速 1.5ml/l溶劑停留時(shí)間 7.0minH2O 20%后運(yùn)行時(shí)間 2.0min 甲醇 80%時(shí)間表時(shí)間0.0%C801.0801.017.00100.0100.03.柱溫箱溫控C4DAD信號(hào)4五、實(shí)驗(yàn)步驟5.1上機(jī)準(zhǔn)備根據(jù)待測(cè)物要求配制 5 個(gè)濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，待測(cè)水樣 1-2查閱文獻(xiàn)，獲得目標(biāo)分析物質(zhì)或相近物質(zhì)的液相色譜分離條件。檢查線路是否連接完好。檢查流動(dòng)相、洗針液是否充足，不足則根據(jù)要求添加。有機(jī)流動(dòng)相必須為進(jìn)口 HP

5、LC 級(jí)，水相可使用 Millipore 純水機(jī)出水或娃哈哈屈臣氏純凈水。所有流動(dòng)相在使用前均需用 0.2 m ,相需每天更換以保持新鮮。標(biāo)樣和樣品在使用前必須用 0.2 m 的針頭式濾器（進(jìn)口非分裝）過濾。用于清洗進(jìn)樣系統(tǒng)及管路。（其中有下劃線部分為實(shí)驗(yàn)課程中未涉及部分）5.2 開機(jī)1打開穩(wěn)壓電源（指針指示 220V Accela AS、Accela PDA、Accela Pump電源開關(guān)。2打開電腦，雙擊工作軟件Xcalibur，在status 狀態(tài)欄下看到 ASPDAPump 三項(xiàng)顯示 readyto download；儀器面板燈除Pump 部分的 RUN 燈呈橙色外，其余燈均為綠色，表

6、明儀器及通訊正常，可進(jìn)行下一步操作。3purge Accela Pump purge purge Accela pump 中的 purge Roadmap中 Instrument Setup 圖標(biāo)，顯示 Instrument Setup 界面，點(diǎn)擊左側(cè)儀器圖標(biāo)中的 Accela Pump，點(diǎn)擊下拉主菜單中 Accela Pump 欄中的 direct control 跳出該界面；在“take pump under control”欄打勾，輸入 flow 為 600 l/min100%play 鍵開始 10min 左右可按停止鍵；同樣的方法可 purge 其它流動(dòng)相通道，直至管路中沒有氣泡。Pu

7、rge 完后將 purge 閥順時(shí)針擰到右邊，取下針筒中的廢液倒入指定的廢液桶。4檢查 Accela AS 門上自動(dòng)進(jìn)樣針筒上部黃色密封圈上端是否有氣泡，如有氣泡則要先行排氣，方法如下：點(diǎn)擊軟件雙擊 Roadmap 中 Instrument Setup 圖標(biāo)，顯示 Instrument Setup 界面，點(diǎn)擊左側(cè)儀器圖標(biāo)中的 Accela As，點(diǎn)擊下拉主菜單中 Accela As 欄中的 direct control 跳出該界面；選擇 Flush，點(diǎn)擊 apply（注意此時(shí)要關(guān)上 AS 5 穩(wěn)定泵系統(tǒng)。雙擊軟件Roadmap 中 Instrument Setup 圖標(biāo)，顯示Instrumen

8、t Setup 左側(cè)儀器圖標(biāo)中的 Accela Pump，點(diǎn)擊下拉主菜單中 Accela Pump 欄中的 direct control 跳出該界面；take pump under control”欄打勾，輸入所需流動(dòng)相啟動(dòng)泵系統(tǒng)，運(yùn)行20min 后方可進(jìn)行其它操作（如運(yùn)行 sequence5.3建立打開 UPLC 工作站 Xcalibur，雙擊 Roadmap 界面中的 Instrument Setup 圖標(biāo)，點(diǎn)擊 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 圖標(biāo)分別設(shè)置參數(shù)。Accela AS 參數(shù)設(shè)置：除 Injection （可設(shè)為 1-20l）外，其余參數(shù)請(qǐng)不要

9、更改。Accela PDA 參數(shù)設(shè)置：根據(jù)樣品實(shí)際情況對(duì) run lengthtime、spectra、channels 等進(jìn)行設(shè)置。Accela Pump 參數(shù)設(shè)置：選擇 Gradient Program 界面，編輯流動(dòng)相梯度（注意正確選擇通道，以免氣泡進(jìn)入系統(tǒng)）參數(shù)設(shè)置完后保存方法（默認(rèn)路徑為：d:UPLCmethod5.4建立sequence點(diǎn)擊 sequence view 圖標(biāo)進(jìn)入 sequence 編輯界面。對(duì)于已建分析方法的樣品，可直接在原來的sequence sequence Unknown InstMeth 和 ProcMethod（如沒有工作曲線時(shí)可先不填此項(xiàng)）輸入方法名及定

10、量分析方法，輸入分析樣品在 Accela As 中的位置以及進(jìn)樣量，以此類推編輯整個(gè)序列，遍及完后保存序列，并點(diǎn)擊按鈕運(yùn)行。5.5 樣品分析點(diǎn)擊按鈕 real time plot play 可以看到實(shí)時(shí)采集的數(shù)據(jù)。開啟儀器半小時(shí)左右，可觀察到儀器信號(hào)基線平穩(wěn)。sequence 設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊 run sequence 在做標(biāo)樣時(shí)，標(biāo)樣也先作為未知樣品分析，待所有樣品分析完后再進(jìn)行定量分析。5.6 分析結(jié)束進(jìn)樣系統(tǒng)清洗：以不含營(yíng)養(yǎng)鹽的流動(dòng)相為樣品（最后一個(gè)樣品）run2-3 次，清洗進(jìn)樣系統(tǒng)。其它添加物）流動(dòng)相洗柱, 至無明顯出峰為止。最后用 80%以上的有機(jī)溶劑保存柱子。關(guān)閉工作站窗口，退出

11、工作站；關(guān)閉儀器面板 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 電源開關(guān)；關(guān)閉電腦，關(guān)閉穩(wěn)壓電源。取出樣品瓶，清潔桌面，在儀器使用記錄本上登記。5.7 數(shù)據(jù)處理定量分析過程（建立工作曲線）參考“Xcalibur 定量分析”說明書。未知樣品結(jié)果分析，打開 sequence 在 Pro Meth 中輸入定量分析方法。選擇需計(jì)算濃度的樣品，點(diǎn)擊 Batch Reprocess Setup，選擇 Quan 欄，Peakdetection&Intergration以及 Quantitation（注意其余選 OK。點(diǎn)擊 Roadmap 進(jìn)入 Quan Browser，打開seque

12、nce 文件名，選擇顯示所有數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊unknows 查看樣品結(jié)果。六、數(shù)據(jù)處理1）原始數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)所得色譜圖 .2353025201510018.2.2776.3.1.1500標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)據(jù)1234min濃度（ppm） 24681019.00134.87348.61467.40678.42535.83146.58255.39265.73582.24112.85825.61835.36748.67759.04218.94137.71353.90473.33989.48266.836（2）數(shù)據(jù)處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，做出峰面積隨濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。鄰苯二甲酸二甲酯100峰0246812濃度1008

13、0y = 5.5987x + 23.564R2 = 0.9853峰02468121212濃度y = 5.7714x + 1.6843R2 = 0.998102468濃度10080y = 8.8354x + 1.6634R2 = 0.9992峰02468濃度y = 6.6384x + 0.6416R2= 0.9985積面峰0246812濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)際單標(biāo)中的物質(zhì)濃度 峰面積濃度七、思考題67.4068.34465.7357.53248.6778.14273.3398.11254.6808.1401、為什么溶劑和樣品要過濾?溶劑和樣品過濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。堵塞。和活塞的磨損。2、流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如 O2相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用 ，可能會(huì)造成熒光猝滅。3、如何防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？沖液（PH=4-7A：請(qǐng)嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾。：請(qǐng)勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C：如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入 0.0001-0.