脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件

1、脊髓灰質炎病毒空斑實驗脊髓灰質炎病毒空斑實驗細胞培養(yǎng)試驗前準備（4人/組）*無菌操作：套腳套，洗手，個人防護器材佩戴，包括：衣帽、口罩、手套。掌握微生物學無菌操作技術。酒精棉球，無菌鑷子，記號筆等。細胞培養(yǎng)試驗前準備（4人/組）脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件 無菌操作過程中要經(jīng)常用75%酒精消毒手。開瓶蓋前也用酒精棉球消毒該區(qū)域。 無菌操作過程中要經(jīng)常用75%酒精消毒手。開試管、瓶子的上1/4 1/3、移液管的下2/3部分不能觸碰任何污染區(qū)域試管、瓶子的上1/4 1/3、移液管的下2/3部分不能觸一、傳代細胞系培養(yǎng)1、優(yōu)點：1) 可以無限的傳代。2) 不少細胞系對病毒很敏感。3) 某些傳代細胞系能

2、在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。4) 生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。缺點：在傳代過程中可能會遭到支原體和病毒的污染。敏感宿主細胞一、傳代細胞系培養(yǎng)敏感宿主細胞二、傳代細胞培養(yǎng)的條件要求1）細胞密度：23105個/ml(Hela 1:3 or 1:4)2）pH范圍 最適，耐受3）培養(yǎng)溫度 哺乳動物細胞一般為37 昆蟲細胞2830二、傳代細胞培養(yǎng)的條件要求*培養(yǎng)基、分散液的使用培養(yǎng)基：加入雙抗使培養(yǎng)基雙抗最終濃度為1%（雙抗儲備液為104U/ml）；加入胎牛血清使其最終濃度為10%； 加谷氨酰胺12ml于100ml培養(yǎng)基中（使用終濃度為14mmol/L ）；用7.5%碳酸氫鈉

3、調(diào)整培養(yǎng)基為，備用。*培養(yǎng)基、分散液的使用培養(yǎng)基：加入雙抗使培養(yǎng)基雙抗最終濃度分散液：用7.5%碳酸氫鈉調(diào)整胰蛋白酶溶液為，備用?；蛑苯邮褂?.02%EDTA作為分散液。分散液：用7.5%碳酸氫鈉調(diào)整胰蛋白酶溶液為，備用?；蛑苯?培養(yǎng)方法1）取長滿單層的細胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。2）加入2ml 胰酶消化液或0.02%EDTA(先用5ml 0.02%EDTA 洗1次)，于37培養(yǎng)箱放置幾分鐘，至細胞間出現(xiàn)空隙或細胞變圓后，倒去消化液。EDTA要盡量甩干。3）加入生長液,反復吹打幾次，使細胞分散成單個細胞，然后分裝于3個小瓶中（1:3）*。再在每個小瓶中補充生長液至10ml15ml ，然后置37培養(yǎng)箱

4、培養(yǎng)，培養(yǎng)5 7天即可長成單層（培養(yǎng)板要做好標記）。*（1:3）：轉入多孔培養(yǎng)板（6孔板）要計算加入量，3ml/孔。每人3孔。 15ml/瓶3=45 ml/瓶（ 加16ml吹打，扣除泡沫）。*培養(yǎng)方法1）取長滿單層的細胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。*（1:3）Hela：人的子宮瘤細胞Vero：非洲綠猴腎細胞Hela：人的子宮瘤細胞正常細胞正常細胞單層細胞的分散單層細胞的分散脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件注意事項：若所用液體、器材未徹底滅菌，可導致細菌或真菌污染，細胞生長緩慢甚至停止、死亡。注意事項：若所用液體、器材未徹底滅菌，可導致細菌或真菌污染，*Han

5、ks液、病毒懸液、 2MEM液體培養(yǎng)基的準備加入雙抗使Hanks液雙抗最終濃度為1%（雙抗儲備液為104U/ml）；用7.5%碳酸氫鈉調(diào)整Hanks液為用Hanks液或1MEM細胞培養(yǎng)基，將Polio V 1型口服疫苗懸液作系列稀釋：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。*如果懷疑病毒懸液污染，可預先用m濾膜過濾除菌。*Hanks液、病毒懸液、 2MEM液體培養(yǎng)基的準備加入操作步驟取5g樣品振蕩10min45ml 10-110-210-310-410-510-62ml2ml2ml加培養(yǎng)基237孵育2.0 h，每15 min搖動1次。操作步驟取5g樣品振蕩10min45ml

6、 10-110-21加入雙抗使2MEM培養(yǎng)基（45 ）雙抗最終濃度為1%（雙抗儲備液為104U/ml）；加谷氨酰胺12ml于100ml培養(yǎng)基中（使用終濃度為14mmol/L ）；加入胎牛血清使最終濃度為2%；用7.5%碳酸氫鈉調(diào)整培養(yǎng)基為，備用。將2MEM液體細胞培養(yǎng)基（胎牛血清濃度為2%）與1%瓊脂糖等量混合，保持在45 。加入雙抗使2MEM培養(yǎng)基（45 ）雙抗最終濃度為1%（雙病毒（PolioV）在傳代細胞中的復制1、選長滿單層的細胞，倒掉（吸出）培養(yǎng)液。2、接種病毒懸液 0.2 ml/孔，空白對照 加培養(yǎng)液0.2 ml/孔3、置溫箱中置37 吸附2 h，且每隔15 搖動一次 。4、然后倒

7、掉（吸出）接種病毒液，鋪上45 ，含0.5%瓊脂糖的維持液覆蓋層，2 ml/孔，置室溫30 min以上。 5、凝固后倒置，于37 培養(yǎng)4872 h。病毒（PolioV）在傳代細胞中的復制1、選長滿單層的細胞，*空斑觀察計數(shù)于每孔內(nèi)加入2 ml甲醛固定20 min，然后甩下瓊脂糖覆蓋層，用自來水將孔內(nèi)殘渣輕輕沖洗干凈。用1%結晶紫溶液覆蓋底層，使瓶壁上的細胞著色10 min ，自來水輕輕沖洗，即可觀察細胞空斑并計數(shù)。 *空斑觀察計數(shù)于每孔內(nèi)加入2 ml甲醛固定20 min，然后脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件PFU： 空斑形成單位 (plaque-forming units)

8、；P： 某稀釋度計數(shù)的空斑數(shù)；n： 某稀釋度平行培養(yǎng)瓶數(shù)；v： 培養(yǎng)瓶接種的病毒液體積。PFU： 空斑形成單位 (plaque-forming u脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件EndEnd大腸桿菌f2噬菌體空斑實驗大腸桿菌f2噬菌體空斑實驗一、意義由于大腸菌群的生物學特性與腸道病毒之間存在一定差異，因此用大腸菌群來指示經(jīng)糞便污染水體的病毒學質量有其不足之處。有研究表明大腸桿菌噬菌體 (Coliphage) f2是一種評價水源污染和水處理過程病毒殺滅效率的有希望的指示生物，其主要優(yōu)點是： （1）大腸桿菌噬菌體 (Coliphage) f2是RNA噬菌體，其核酸性質、粒子大小、 pH穩(wěn)定性等均與腸道病

9、毒極為接近。（2）大腸桿菌噬菌體經(jīng)糞便排泄，在水和廢水中存在的數(shù)目比腸道病毒多，其數(shù)量的季節(jié)變化也與腸道病毒相似。（3）對外界環(huán)境和氯、碘等消毒劑的抵抗力也與腸道病毒相似或略強一些。（4）大腸桿菌噬菌體的檢測與計數(shù)等方法也較簡易。一、意義由于大腸菌群的生物學特性與腸道病毒之間存在一定差異，二、原理根據(jù)f2噬菌體感染大腸桿菌285宿主菌后，可在宿主細胞內(nèi)增殖、最后裂解細胞的特性，將噬菌體適當稀釋，再感染宿主細胞，并利用固體瓊脂限制單個感染灶的無限擴散，而形成肉眼可見的空斑。一般而言，每個空斑即由一個噬菌體增殖裂解而成，因此可利用此原理定量檢測樣品中的噬菌體數(shù)量。 二、原理病毒數(shù)量和感染性測定1、

10、蝕斑試驗2、ID50 或 TCID50 病毒感染雞胚、動物或細胞后，引起 50% 發(fā)生死亡或病變的最小量。 病毒感染單層細胞后，產(chǎn)生的局限性病灶（此區(qū)域細胞發(fā)生溶解），稱蝕斑，蝕斑是由一個感染性病毒體復制形成的，稱蝕斑形成單位，病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升的蝕斑形成單位PFU來表示。病毒數(shù)量和感染性測定1、蝕斑試驗2、ID50 或 TCID5三、試劑及培養(yǎng)基制備略實驗分組： 3人/組三、試劑及培養(yǎng)基制備略四、實驗步驟大腸桿菌285宿主菌增菌培養(yǎng)： 接種12個菌落至1020 ml營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，置37 培養(yǎng)1012 h，備用。融化2%營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，將50 左右營養(yǎng)瓊脂倒入平皿，1

11、020 ml/皿，冷卻凝固待用。四、實驗步驟大腸桿菌285宿主菌增菌培養(yǎng)： 接種12個菌脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件融化小試管中1%營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，置45 保溫，待用。用無菌蒸餾水，將f2噬菌體懸液作系列稀釋：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。對以上平皿，按上述稀釋度編號，每個稀釋度3皿平行。融化小試管中1%營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，置45 保溫，待用。脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件將不同稀釋度f2噬菌體稀釋液1 ml、285宿主菌懸液0.2 ml和約45 ，1%營養(yǎng)瓊脂5 ml，混勻，倒入以上平皿，冷卻。平皿倒置37 培養(yǎng)1624 h。觀察透明空斑并計數(shù)

12、。將不同稀釋度f2噬菌體稀釋液1 ml、285宿主菌懸液0.245 ， 1%營養(yǎng)瓊脂5 ml f2噬菌體稀釋液1 ml菌懸液0.2 ml混勻靜置、冷卻45 ， 1%營養(yǎng)瓊脂5 ml f2噬菌體稀釋液1 ml菌PlaquePlaquePFU： 空斑形成單位 (plaque-forming units)；P： 某稀釋度計數(shù)的空斑數(shù)；n： 某稀釋度平行培養(yǎng)瓶數(shù)；v： 培養(yǎng)瓶接種的病毒液體積。PFU： 空斑形成單位 (plaque-forming uEndEnd脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件操作步驟稱取10g土樣振蕩10min90ml9ml9ml9ml9ml 9ml1ml1ml1ml1ml1ml10-11

13、0-210-310-410-510-620ml20ml20ml倒培養(yǎng)基2操作步驟稱取10g土樣振蕩10min90ml9ml9ml9m脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件CPECPE病毒培養(yǎng)時出現(xiàn)的CPE病毒培養(yǎng)時出現(xiàn)的CPE電泳（PAGE）鑒定輪狀病毒（Rotavirus）實驗第一次實驗意義在腹瀉病的病毒病因中，輪狀病毒為主要病因，它占整個腹瀉病的1/4。在經(jīng)濟發(fā)達國家，急性腸胃炎住院的嬰幼兒中約1/3-1/2以上是輪狀病毒腹瀉，而在發(fā)展中國家，輪狀病毒為主要病因。急性腹瀉的病因頗多，往往需要更準確的實驗室診斷進行確診，即從糞便中檢測輪狀病毒或其抗原。PAGE是輪狀病毒腹瀉分子

14、流行病學調(diào)查和臨床確診常用的方法。原理輪狀病毒RNA由11個片段的雙鏈RNA組成，在一定的pH環(huán)境中，分節(jié)段的RNA帶負電荷，由于電場力的作用，帶負電荷的RNA片段向正極方向泳動，鑒于各RNA片段本身結構、帶電荷不同，因此，在一定時間內(nèi)各分子量不同的RNA片段泳動到聚丙烯酰胺凝膠板上特定的位置，形成各自的致密區(qū)帶，經(jīng)硝酸銀染色，呈現(xiàn)出RNA區(qū)帶電泳圖型，從而使RNA片段得以分離和分析。電泳（PAGE）鑒定輪狀病毒（Rotavirus）實驗第一次實驗步驟a)提取RNA (供PAGE電泳用)用PBS制備10%的糞便懸液：0.25 g糞便加入2.25 ml PBS取10%糞便懸液250l于1.5 m

15、l離心管（編號），加50l裂解液震蕩器上混勻 （3次）。37孵育30 min。臨床樣本：1、3、4、5實驗步驟臨床樣本：1、3、4、54. 加入4存放重蒸過的苯酚300l，震蕩混勻 （3次）。5. 12000轉/ min，離心2 min。液體分層。6. 吸出上層液體至另一小離心管中（同樣編號），不要擾動中間相和下層液體，棄原離心管。7. 加入氯仿300l，震蕩混勻 （3次）。8. 12000轉/ min，離心2 min。液體分層。9. 吸出上層液體至另一小離心管中（同樣編號），不要擾動中間相和下層液體，棄原離心管。重復49步驟12次加入-20保存的無水乙醇500l，再加入5 M NaCl 5l

16、，蓋緊小試管，倒轉來回徹底混勻3次。-20靜置過夜，或-70 2小時以上。4. 加入4存放重蒸過的苯酚300l，震蕩混勻 （加氯仿加苯酚取上層混勻離心混勻離心取上層加氯仿加苯酚取上層混勻離心混勻離心取上層第二次實驗第二次實驗轉/ min，離心1520 min。13. 離心后立即倒掉液體，離心管倒立，讓液體控干，下邊墊吸水紙，然后將離心管直立，室溫放置1530 min，待其干燥 （讓乙醇揮發(fā)）14.每管加入50l滅菌的雙蒸水，溶解RNA，放-20保存，即為PAGE用RNA轉/ min，離心1520 min。b) PAGE板的制備和電泳用酒精擦洗兩塊玻璃板、梳子，用紙擦干凈、涼干。組裝固定兩塊玻璃

17、板。 封底膠：瓊脂糖1 g，加熱溶解在100 ml雙蒸水，用融化的瓊脂糖封住玻璃板的三個邊，以防漏膠。b) PAGE板的制備和電泳3. 制備分離膠： 0.75 M Tris-HCl (pH 8.8) 20 ml 0.1 M EDTA 0.4 ml 丙烯酰胺溶液（單體） 13.3 ml 雙蒸水 4.7 ml混勻，加入3%過硫酸銨1.6 ml，TEMED 70 l后迅速混勻，立即倒入玻璃板中間，離梳齒11.5 cm后終止，然后加入雙蒸水，直立靜置1h左右。制備濃縮膠前，倒掉雙蒸水。2010年：1.4 ml + 60 l3. 制備分離膠：2010年：1.4 ml + 60 Tris (Figure

18、3) is used to remove ammonia and amine contaminants and to keep the gel at a constant pH. Figure 3 - Tris Molecule Tris (Figure 3) is used to remFigure 5 - Acrylamide Molecule Figure 6 - BIS Molecule Figure 7 - Ammonium Persulfate (APS) Molecule Figure 8 - TEMED Molecule Figure 5 - Acrylamide Molecu

19、leFigure 9 - Polyacrylamide Matrix Figure 9 - Polyacrylamide Matr第三次實驗第三次實驗4. 制備濃縮膠： 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 5.0 ml 0.1 M EDTA 0.2 ml 丙烯酰胺溶液（單體） 2.0 ml 雙蒸水 12.4 ml混勻，加入3%過硫酸銨0.4 ml，TEMED 20 l后迅速混勻，立即倒入玻璃板中間，插入梳子（不得有氣泡），然后不斷補充梳齒空間，直至徹底凝固。2010年：0.8 ml + 40 l4. 制備濃縮膠：2010年：0.8 ml + 40 l5. 加樣： 濃縮膠凝固后，固定

20、好玻璃板，垂直向上拔出梳子，整理加樣槽。加入電泳液并使液面高過齒面。取加樣緩沖液10 l，樣品RNA 10 l，在憎水膜上混勻，加入一個齒孔中，不要漏入兩旁的齒孔，不要產(chǎn)生氣泡。如此操作，加入所有樣品。6. 電泳： 正確接好電線正、負極，單片膠1820 mA,穩(wěn)流條件16小時，雙片膠約40 mA, 穩(wěn)流條件16小時。溴酚藍移動至底邊1 cm可終止電泳。Figure 12 - Bromophenol Blue Molecule 5. 加樣：Figure 12 - Bromopheno第四次實驗第四次實驗c) 顯影與定影 電泳斷電后，取下玻璃板，輕輕撬開玻璃板，將玻璃板與凝膠分離，在凝膠左下角切一

21、小口作記號顯影： 將凝膠放入AgNO3顯影液，振蕩1 h,倒掉液體，單蒸水洗34遍，加入顯影增強液，甲醛2ml，振蕩1020 min，待條帶清晰出現(xiàn)，單蒸水洗34遍。定影：將凝膠放入終止固定液中，觀察結果，拍照。c) 顯影與定影脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件EndEndSDS (Sodium dodecylsulfate) is a detergent (Figure 4) that binds to proteins to give them an overall negative charge, allowing proteins to migrate in one direction onl

22、y. Thus, they can be easily separated according to size. Figure 4 - SDS Molecule SDS (Sodium dodecylsulfate) isFigure 11 - Beta-Mercaptoethanol (B-ME) Molecule Figure 11 - Beta-MercaptoethanFigure 13 - Movement of ProteinsFigure 13 - Movement of ProteiELISAELISA是一種免疫測定法。免疫測定（immunoassay，IA）是應用免疫學技術檢

23、測樣本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。ELISAELISA是一種免疫測定法。免疫測定（immunELISA的原理ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色

24、產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA的原理ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化 木瓜酶裂解部位 胃蛋白酶裂解部位 木瓜酶裂解部位脊髓灰質炎病毒空斑試驗課件免疫技術常用的酶及其底物酶底顯色反應測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色黃色棕色蘭色藍綠色492*460*449425642堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色紅色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色深藍色405,420-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光黃色360,450420 * 終止劑為2mol/L H2SO4 * 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑。 免疫技術常用的酶及其底物底顯色反應測定波長辣根過氧化物酶鄰敏感性在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為510g/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿。標記免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平。例如，用放射免疫測