血凝抑制實驗

1、摘要：目前在禽流感血凝抑制試驗方面存在很多問題，會對血凝抑制試驗的意義造成影響從而導致不正確的結(jié)果；禽流感抗原也存在相的差異，在實際檢測中也容易出現(xiàn)誤導。關(guān)鍵詞： 血凝抑制 相的差異 標定Problems in Hemagglutimation Inhibition Test with Avian InfluenzaLiu Ping , Liu Dong , Li Bin , Wang QunYi ,Huan XiuRong,Wang ZongSheng ，F(xiàn)an GenCheng, Du YuanZhaoQingdao YEBIO Bioengineering Co,National Ani

2、mal QuarantineInstitute ,Ministry of Agriculture ,Qindao ShandongAbstract:Quite a few problems exist with regard to hemagglutinationtest with avan influenza,affecting HI test meanings and leading towrong results.Phase variation exists in avian influanzaantigen,causing mistakes in practical operation

3、 of HI test.Keywords: Hemagglutination inhibition,phase variation,standardization禽流感病毒能夠與雞紅細胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制實驗（HI）。由于血凝反應可被特異性抗體所抑制，抗體與病毒結(jié)合后，血凝素不能吸附于紅細胞表面的受體上，因此血凝抑制試驗可以用于：1）檢測血清中的抗體水平。2）鑒定病毒。3）輔助診斷病毒性疾病。4）作為適時免疫的輔助手段，能避免免疫失敗、免疫空擋及重復免疫造成的損失。目前在禽流感血凝抑制試驗方面存在很多問題，會對血凝抑制試驗的意義造成影響從

4、而導致不正確的結(jié)果。一、 由于禽流感病毒變異較快，所以在血凝抑制試驗中經(jīng)常會出現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的相同亞型的禽流感抗原所測同一血清的血凝抑制價不同，禽流感亞型病毒株按其血凝抑制試驗中所表現(xiàn)的親和力不同而分為三種類型：對本株和異株免疫血清均呈較高效價的為“R”相；對本株效價高對異株低的為“P”相；對本株及異株均低的為“Q”相。由此可見養(yǎng)殖戶經(jīng)常反映的打你們廠家的疫苗去別的地方檢測結(jié)果往往會很低，這就是我們所說的“P”相，即抗原相的差異。如果在試驗中出現(xiàn)相的差異所測結(jié)果會相差2-3個滴度，所以在血凝抑制試驗操作時，挑選親和相毒株作為測定抗原較好，這樣會提高診斷的靈敏度(如下表)。對禽流感毒株進行抗原分

5、析時，必須采用交叉的血凝抑制試驗，而不能采用單向的血凝抑制測定，以排除相別的影響。同一血清用不同抗原檢測的結(jié)果血清2626二、 禽類血清中往往含有非特異性血凝抑制因子，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制試驗時會出現(xiàn)對照孔和對照孔后 2-3 孔有凝集現(xiàn)象。因此，在利用血凝抑制試驗進行血清抗體測定之前，有必要對血清中非特異性因子進行排除。熱滅活是一種排除非特異性因子的有效方法，但對特異性抗體破壞較大。利用受體裂解酶處理血清在美國禽流感診斷中已廣泛應用。但經(jīng)過我們大量的臨床試驗發(fā)現(xiàn)水禽血清在經(jīng)過受體裂解酶處理后有明顯的差異，而雞的血清卻沒有明顯差異，所以在做血凝抑制試驗時可對水禽血清用受體裂解酶進行處

6、理，雞血清不作處理結(jié)果影響不大。三、在禽流感血凝抑制試驗中抗原標定也是至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)。首先在試驗之前要對禽流感抗原用已知效價的標準陽性血清進行標定，以確定抗原的純度?？乖渲仆旰螅鑼λ渲频目乖M行標定，看所配制的抗原是否達到所需標準，如工作抗原效價過高或過低對結(jié)果都有一定的影響。過高，測定抗體效價偏低；過低，測定效價過高，甚至很高。所以在禽流感血凝抑制試驗中必須對抗原進行標定。四、在進行試驗操作時很容易出現(xiàn)錯誤，所以進行實驗時一定要嚴格操作，每次測定應有嚴格的溫度范圍和作用時間，出現(xiàn)錯誤時要認真查找原因，以免類似錯誤再次出現(xiàn)。另外，所用抗原應是穩(wěn)定性好，效價高的濃縮抗原。以下是容易出現(xiàn)

7、的錯誤：1.對照孔凝集 鹽類凝集：所謂鹽類凝集即稀釋液中氯化鈉達至一定高濃度時，即使沒有血清抗體也能發(fā)生凝集反應。 當生理鹽水被細菌污染時也可出現(xiàn)對照孔凝集。 血清變質(zhì)或受細菌污染。2.全部凝集 當紅細胞受細菌污染或保存時間過長可出現(xiàn)此現(xiàn)象。 抗原滴加時出現(xiàn)失誤，工作抗原效價過高。 生理鹽水受細菌污染或其它因素.3、 紅細胞全部下滑當配制抗原時，配制工作抗原效價過低，不足以凝集雞紅細胞。加樣時所有孔全部加成生理鹽水亦出現(xiàn)全部下滑現(xiàn)象。4、不同來源、不同濃度的紅細胞會使結(jié)果差異很大，所以紅細胞來源一定要相同：一般需要 3 只或 3 只以上公雞來提供紅細胞，將 3 只以上公雞紅細胞混合在一起。也可

8、由 1 只公雞來提供紅細胞，但必須經(jīng)臨床多次使用證明是可行的。有抗體雞提供的紅細胞需要更多次數(shù)洗滌。但要注意有時不同的公雞提供的紅細胞對禽流感 H5 亞型抗體測定，效價差異很大。不同濃度的紅細胞對抗體測定也有影響。5、溫度對實驗結(jié)果也有影響，一般要求在室溫 25-37進行實驗，當實驗溫度低于 4時紅細胞有時會發(fā)生自凝現(xiàn)象。6、抗原與抗體作用時間過長或過短對結(jié)果影響較大：過短出現(xiàn)凝集不完全；過長出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象。7、96 孔 V 型板是否洗凈，是否光滑也會影響實驗結(jié)果。總之在進行禽流感血凝抑制試驗時應綜合考慮各方面因素，制定一個標準化操作方法以免對結(jié)果判斷產(chǎn)生誤差，只有把試驗標準化才能正確評價疫苗免疫存在的意義。新技術(shù)員必看血凝抑制試驗易出的問題發(fā)布時間：2011-01-06114 個44個4個1微24413 4個4個423454種 4個個3微升234個68當811x8183只按值31淺談血凝抑制試驗中存在的問題及解決方法(如新城疫、禽流感病毒等) (HI)1. 42. 33.4.4(HAU)4個 4 4個抗原配制不準確. 4 4 4-6 第3 4 1%1-5 1 50% 4 4個 4 4 1 4 2-83天內(nèi)效價基本無變化，1 2-83 34 1 4 16. 2025 20 15 20257