分子診斷策略與常用技術(shù)培訓(xùn)課件

1、分子診斷策略與常用技術(shù)分子診斷策略與常用技術(shù) 一、分子診斷的概念和特點(diǎn) 概念： 利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，通過檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)或其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)人體健康狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。 傳統(tǒng)的診斷：表現(xiàn)型基因型 基 因 診 斷：基因型表現(xiàn)型 （ 逆向診斷）2分子診斷策略與常用技術(shù) 一、分子診斷的概特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高早期診斷性 適應(yīng)性強(qiáng)一、分子診斷的概念和特點(diǎn)檢測(cè)致病基因突變；分析與疾病連鎖的遺傳標(biāo)志；建立多基因疾病表型克隆；定量分析致病基因的表達(dá)水平 已明確疾病表型與基因型的關(guān)系分子診斷的前提3分子診斷策略與常用技術(shù)特點(diǎn)一、分子診斷的概念和特點(diǎn)檢測(cè)致病基因突變；分析與疾病連

2、鎖二、分子診斷策略直接診斷直接檢測(cè)致病基因的突變 基因突變類型缺失、點(diǎn)突變、重復(fù)、插入等間接診斷應(yīng)用DNA多態(tài)性為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，確定待測(cè)者是否得到帶有致病的染色體，從而間接地作出診斷 DNA多態(tài)RFLP、VNTR、SNP4分子診斷策略與常用技術(shù)二、分子診斷策略直接診斷直接檢測(cè)致病基因的突變間接診斷DNA多態(tài)（DNA Polymorphism） 群體中每個(gè)個(gè)體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對(duì)基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：稱限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如STR其

3、重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即 VNTR ，為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。二、分子診斷策略5分子診斷策略與常用技術(shù)DNA多態(tài)（DNA Polymorphism）二、分子診斷策三、分子診斷常用技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)等位基因特異寡核苷酸探針(allele specific oligonucleotide, ASO)DNA限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析PCR-SSCPDNA測(cè)序 DNA芯片技術(shù) 6分子診斷策略與常用技術(shù)三、分子診斷常用技術(shù)核

4、酸分子雜交技術(shù) 6分子診斷策略點(diǎn)突變（C to T）5335G53引物1引物2探針1探針2A等位基因特異寡核苷酸探針（ASO） 7分子診斷策略與常用技術(shù)點(diǎn)突變（C to T）5335G53引物1引物2分子診斷策略與常用技術(shù)培訓(xùn)課件RLFP分析法9分子診斷策略與常用技術(shù)RLFP分析法9分子診斷策略與常用技術(shù)RFLP分析 優(yōu)點(diǎn) 分辯率高，無需標(biāo)記,重復(fù)性好，簡(jiǎn)便快速直觀 主要用于核酸變異分析比較, 微生物的分群分型，癌基因分析，遺傳病的診斷等。 局限 只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點(diǎn)改變篩選，檢測(cè)效率低。10分子診斷策略與常用技術(shù)RFLP分析 優(yōu)點(diǎn)10分子診斷策略與常用技術(shù) 原理 將經(jīng)擴(kuò)增的DNA片

5、段變性形成單鏈，由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳的遷移率不同，通過與標(biāo)準(zhǔn)物的對(duì)比，即可檢測(cè)出有無變異。 優(yōu)點(diǎn) 檢測(cè)基因變異，具有操作簡(jiǎn)便、快速特點(diǎn)，不需特殊設(shè)備，適用于大樣本篩選。 己廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各種病原體基因的點(diǎn)突變及缺失突變，基因的多態(tài)性分析等。PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）11分子診斷策略與常用技術(shù) 原理PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）11分子診斷策略（ PCR-SSCP）示意圖12分子診斷策略與常用技術(shù)（ PCR-SSCP）示意圖12分子診斷策略與常用技術(shù)DNA測(cè)序13分子診斷策略與常用技術(shù)DNA測(cè)序13分子診斷策略與常用技術(shù)DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果

6、舉例14分子診斷策略與常用技術(shù)DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例14分子診斷策略與常用技術(shù)DNA芯片技術(shù)15分子診斷策略與常用技術(shù)DNA芯片技術(shù)15分子診斷策略與常用技術(shù)四、分子診斷的應(yīng)用及舉例遺傳疾病腫瘤感染性疾病判斷個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定16分子診斷策略與常用技術(shù)四、分子診斷的應(yīng)用及舉例遺傳疾病16分子診斷策略與常用技術(shù)Mst酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)53正?；?3突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析GAG GTG 谷Aa纈Aa17分子診斷策略與常用技術(shù)Mst酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)53正?；?3+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析18分子診斷策略與常用技術(shù)+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮 Normal Gene Probe與正常 Probe 雜交穩(wěn)定 Mutation S Gene Probe與異常 S雜交 穩(wěn)定 鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的ASO探針雜交19分子診斷策略與常用技術(shù) Normal Gene Probe與正常 斑點(diǎn)雜交結(jié)果：鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的ASO探針雜交/ /S S/S正常探針異常探針20分子診斷策略與