發(fā)熱伴血小板減少綜合征概述

1、關于發(fā)熱伴血小板減少綜合征概述第1頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV的發(fā)現(xiàn)和研究概況 第2頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四病毒性出血熱一類由病毒引起的，以發(fā)熱、出血、休克、多器官損害為主要表現(xiàn)的嚴重急性傳染病。 病毒性出血熱具有較高病死率。 第3頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四病毒性出血熱的病原主要為4個病毒科 沙粒病毒科 布尼亞病毒科 黃病毒科 絲狀病毒科 均為有包膜單鏈RNA病毒 動物或昆蟲作為宿主和媒介第4頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四2009-2010年，在河南、湖北和山東等地一些丘陵、山

2、區(qū)相繼出現(xiàn)病原不明癥狀類似的病人，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、消化道癥狀、血小板減少、白細胞減少及多臟器功能損傷等，少數(shù)重癥病例死亡。第5頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四第6頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四第7頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四中國疾病控制中心對該新發(fā)傳染病加強監(jiān)測，利用未知病原快速篩查技術體系，在湖北和山東3名患者血清中同時發(fā)現(xiàn)新病毒基因序列。從湖北、山東、河南、安徽、江蘇、遼寧6省病人血清標本中分離到20株同種病毒。解析了6省11株新病毒全基因組信息。并從70% 急性期病人血清中檢測到病毒RNA。確診病人恢復期血清中特異性

3、抗體轉陽或4倍增高。第8頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四鑒定新病毒 研究工作從病原體分離鑒定到病因關系的論證，成功確定該新發(fā)傳染病病原為： 布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新病毒第9頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV) 第10頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV一般生物學特性SFTSV人感染后可出現(xiàn)病毒血癥，從早期病人血清中可分離到病毒，病毒感染細胞譜較廣，培養(yǎng)上清超濾濃縮

4、后經(jīng)蔗糖密度剃度離心可獲得純化的病毒顆粒，在電鏡下呈球形或橢球形，直徑約80100nm。病毒顆粒有雙層脂質包膜，包膜表面有糖蛋白形成的突起，內有病毒基因組與核蛋白形成的核衣殼結構。 第11頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四第12頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四第13頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四目前國際上公認將白蛉病毒屬病毒分成兩大組，一組是對人類致病的，如立夫特谷熱病毒等，另一組一般對人類不致病，如烏庫病毒等，新發(fā)現(xiàn)的SFTSV為白蛉病毒屬第三組病毒。第14頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV感染流

5、行病學特征 我國目前已在河南、湖北、山東、江蘇、安徽、遼寧、浙江、江西8省發(fā)現(xiàn)發(fā)熱伴血小板減少綜合征（SFTS）病例，多散發(fā)于呈丘陵地貌的農(nóng)村地區(qū)，呈散在分布。發(fā)病時間一般開始于3月，高峰期在5-7月份，可延續(xù)至11月份。SFTSV易感人群年齡分布在39-83歲之間，其中50歲以上患者占75；沒有明顯性別差別。第15頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四宿主和媒介 SFTSV傳播媒介主要是蜱蟲，人類可通過蜱蟲叮咬而得病，已從長角血蜱中分離到SFTS病毒，其核酸序列與人源病毒具有95左右同源性。SFTSV宿主范圍較廣，病毒可感染牛、羊、狗等脊椎動物和蜱等節(jié)肢動物，在牛、羊、狗、雞

6、、豬血清中存在SFTS布尼亞病毒抗體，并已從牛、羊、狗中分離到病毒。發(fā)現(xiàn)SFTS死亡病人血清中病毒載量可達107TCID50，直接接觸高感染性病人血液可導致人人直接傳播。第16頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV病毒循環(huán)第17頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTS臨床特征及致病機理 SFTS患者沒有特異的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和胃腸消化道癥狀，可見局部淋巴結腫大。實驗室化驗常見血小板減少（100）和白細胞減少（99）。大多數(shù)患者很快發(fā)展為多器官功能異常，表現(xiàn)為血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶，磷酸肌酸激酶同工酶水平升高

7、。常見蛋白尿（84）和血尿（59）。 臨床特征第18頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四絕大多數(shù)患者預后良好，少數(shù)病例病情危重，出現(xiàn)意識障礙、皮膚淤斑、消化道出血等，可因休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內凝血（DIC）等多臟器功能衰竭死亡。動態(tài)監(jiān)測結果顯示幸存者中病毒載量多在發(fā)病后7天開始下降，但病死者其病毒載量仍維持在較高水平，可發(fā)生經(jīng)血液人人傳播。 第19頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四在發(fā)病第7-13天，血清病毒載量、血清谷草轉氨酶，乳酸脫氫酶異常提示可能會導致更為嚴重的出血癥狀、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、DIC、MOF及血清中組織酶升高。病死率約12左右。第2

8、0頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四新型布尼亞病毒的致病機理尚待更多的臨床數(shù)據(jù)和實驗室研究進行闡明。選取發(fā)熱伴血小板減少綜合征病不同預后的患者，利用Luminex技術平臺，檢測了27種細胞因子的動態(tài)變化，并通過標準曲線對每種因子進行定量。 致病機理第21頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四研究結果顯示SFTS患者急性期血清中促炎性細胞因子IL1-RA，IL-6，IL-8，IL-10，MCP-1，G-CSF及IP-10水平大幅度提升，而PDGF-BB和RNATES水平則顯著降低，且病毒載量與血清細胞因子水平具有相關性。 研究結果提示高病毒載量可能會導致危重病

9、人的嚴重病理變化，而促炎性細胞因子異?？赡芘cSFTS癥狀加重有關。 第22頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四在SFTS患者血清中幾乎檢測不出干擾素。已有的布尼亞病毒的研究認為，布尼亞病毒科的病毒通常不能有效促進抗病毒復制的干擾素生成，有些非結構蛋白具有拮抗干擾素的作用。 基于這些資料推測，新型布尼亞病毒可能通過抑制靶細胞生成干擾素而在體內復制，在這一過程中可通過誘導機體產(chǎn)生炎癥性趨化因子而引發(fā)后續(xù)的免疫炎癥反應。 第23頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四將從患者血清中分離的SFTSV接種到小鼠體內，在感染急性期可引發(fā)特征性臨床癥狀，即血小板減少和白細胞減

10、少發(fā)現(xiàn)病毒核酸在血、肝、脾、腎中均可檢出病毒感染可有效地誘導病毒特異性IgM、IgG以及中和抗體的生成發(fā)現(xiàn)SFTSV在肝、脾、腎引起顯著病理變化，與臨床觀察到的肝腎損傷癥狀一致。SFTSV感染動物模型、免疫學、病理學第24頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四發(fā)現(xiàn)脾巨噬細胞為病毒感染復制的靶細胞，在SFTSV感染的脾組織中，巨噬細胞大量增加，血小板也出現(xiàn)大量沉積，并且熒光共定位研究顯示病毒與血小板共定位于巨噬細胞的胞漿中。結合細胞學實驗發(fā)現(xiàn)SFTSV可以黏附于人血小板并引發(fā)巨噬細胞對血小板的吞噬，目前的研究提示SFTSV感染導致的血小板減少可能是由于脾巨噬細胞對病毒黏附血小板的

11、異常清除所致。第25頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV實驗室檢測方法 第26頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四標本-病人血清病毒核酸診斷病毒特異性IgM抗體診斷病毒分離培養(yǎng)雙份血抗病毒IgG抗體檢測（免疫熒光、ELISA）空斑減少或微量中和試驗檢測中和抗體。 第27頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四病毒血癥期IgMIgM、IgG、中和抗體和總抗體：ELISA 和中和實驗等病毒分離方法0IgG核酸檢測方法病程SFTSV病毒感染的動態(tài)指標與檢測第28頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四樣本病毒分離RNA提取cD

12、NA合成一步法RT-PCRPCR電泳分析實時、定量分析基因序列分析IFA 或FA核酸檢測流程圖第29頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四常用PCR檢測方法常規(guī)PCR檢測單輪PCR檢測2輪PCR檢測（套式或半套式PCR）實時定量PCR基于SYBR Green I的PCR檢測基于探針的PCR檢測方法：HybProbe/Taqman根據(jù)檢測靶標單元PCR檢測方法多元PCR檢測方法第30頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四核酸檢測流程反應體系混合物正、反向引物混合物特異性熒光探針1) 核酸分離2) Real-time PCR 檢測20 l5 l反應條件取決于病原體特

13、異性PCR儀合適的PCR管第31頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四1、帶手套2、注意及時更換手套，盡量保持分離RNA的管子封閉。3、分離RNA保持在冰上4、使用滅菌和無RNA酶的耗材5、用0.1M NaOH，1mM EDTA（或氯仿）和無RNA酶水沖洗塑料耗材；玻璃器皿使用含去污劑的水反復沖洗，然后240干烤4小時，或充滿0.1%DEPC的水37 過夜（或不少于孵育12小時）。6、溶液：如果不能確認是否無RNA酶（RNase-free)，應用0.1%DEPC處理。7、分離的RNA保存于-20 或以下冰箱，避免反復凍融，可考慮添加額外的RNA酶抑制劑。需要時再分離RNA。核酸

14、檢測的注意點：防止RNA酶污染第32頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四PCR交叉污染的來源與控制PCR不需無菌操作，但應十分注意交叉污染常見的污染源：以前PCR擴增產(chǎn)物的污染；樣本處理污染；交叉污染的控制：隔離操作區(qū)：至少有三個區(qū)域，標本核酸分離、PCR反應體系配制、PCR擴增及結果分析。實驗中盡量減少各區(qū)之間交叉走動，穿著不同工作服。 操作技能：戴手套并及時更換、仔細操作、液體應該分裝、用防氣溶膠的吸頭。妥善處理廢棄物第33頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四污染的處理 及時清除操作廢棄物 次氯酸（2%-5%）+70%乙醇擦拭污染的工作區(qū)表面次氯酸（2%

15、-5%）過夜浸泡使用過的PCR管存放架等以備下次使用耗材從倉庫直接運送到PCR操作間，不經(jīng)過不必要的實驗室UV照射：表面、液體等，由于UV對500bp以下的DNA損害很小，所以可以處理已加入引物的反應液。內切酶和DNase I 可以對未加入模板和Taq酶的PCR反應液進行處理，處理完后加熱滅活這些酶，然后進行PCR反應。 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。第34頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV細胞培養(yǎng)分離與鑒定1 目的用于患者、宿主動物及媒介生物標本中發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）細胞培養(yǎng)分離與鑒定。2 適用范圍適用于SFTS患者、宿主動物及媒介生物樣本

16、的檢測。第35頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四3.樣品接收和準備3.1 核對被檢患者的姓名、性別、年齡、編號及檢測項目；核對被檢樣本的來源、種類、編號、檢測項目等。3.2 用于檢測的待測樣品不能及時檢測的儲存在-70。4.實驗原理標本中病毒通過在敏感組織細胞中培養(yǎng)放大，有利于病毒的進一步分析與鑒定，可以用來分離SFTSV的敏感細胞包括：Vero, Vero-E6等。第36頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四第37頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTS血清學檢測方法1.捕獲法Mac-ELISA2.間接法ELISA3.雙抗原夾心法EL

17、ISA4.雙抗體夾心法ELISA5. 空斑減少中和試驗第38頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四IgM捕捉法ELISA檢測SFTSV的IgM抗體1 目的檢測SFTSV IgM抗體。2 適用范圍適用于患者血清或血漿中SFTSV IgM抗體的快速檢測。3.樣品接收和準備3.1 核對被檢樣品（血清或血漿）。3.2 人血清或血漿，含有EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本試驗。樣品中無微生物，可在2-8儲存一周，超過此期限建議-20以下凍存，避免反復凍融，使用前將樣品室溫平衡30分鐘以上，冷凍樣品實驗前需混勻。第39頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四間接法

18、ELISA-IgG抗體1 目的：檢測新布尼亞病毒IgG抗體。2 適用范圍：適用于血清或血漿中抗新布尼亞病毒IgG抗體的快速檢測。3.樣品接收和準備3.1 核對被檢樣品（血清或血漿）。3.2 本試劑使用人血清或血漿，含有EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本試驗，樣品中無微生物，可在2-8儲存一周，超過此期限建議-20以下凍存，避免反復凍融，使用前將樣品室溫平衡30分鐘以上，冷凍樣品實驗前需混勻。第40頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四雙抗原夾心法ELISA-總抗體1.目的：檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）特異性抗體。2 適用范圍：適用于人或宿主動物血清或

19、血漿中SFTSV抗體的快速檢測。3.檢測原理：本方法采用純化的重組SFTSV核蛋白抗原包被酶標板，結合樣本中SFTSV特異性抗體，再加辣根過氧化物酶標記的核蛋白抗原和已被板上抗原捕獲的抗體反應。用以檢測SFTSV特異性抗體。適用于SFTSV感染狀況的調查及其它實驗性研究。當恢復期樣本總抗體滴度較急性期有4倍或4倍以上升高時，具有診斷意義。第41頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗1 目的檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）抗原。2 適用范圍適用于檢測組織培養(yǎng)、媒介、宿主動物標本、患者急性期血中SFTSV抗原檢測。3 檢測原理本方法

20、采用病毒特性性多克隆抗體包被酶標板捕獲標本中病原抗原，加病毒特異性單克隆抗體結合病毒抗原，用以檢測病毒抗原。第42頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTSV空斑減少中和試驗1 目的:檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）中和性抗體和血清分型。2 適用范圍:適用于診斷、血清流行病學調查3 樣品接收和準備3.1 核對被檢樣品患者的姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等。3.2 用于檢測的待測樣品，如不能及時檢測儲存在-20。4.檢驗原理空斑就是對活性染料（中性紅）不著色的被病毒破壞的死細胞灶。有些病毒盡管不形成細胞病變卻可使細胞的一些代謝機制受影響，如對中性紅的吞噬能力減弱

21、或喪失。在著色的活細胞單層紅色背景襯托下呈無色的斑點既空斑。測定形成空斑的數(shù)量可準確地了解病毒的感染滴度，獲得比50%細胞培養(yǎng)感染滴度(TCID50)更準確的結果。利用抑制病毒繁殖減少空斑形成數(shù)，可提供一種測定血清中中和抗體和抗病毒物質的敏感方法。第43頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四第44頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四SFTS樣本的包裝運輸與準運申請 第45頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四您 將 會 知 道 感染性物質的正確包裝與分類 感染性物質的正確運輸與申請第46頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四法

22、律 、 法規(guī)依據(jù) 國務院第424號令 病原生物實驗室生物安全管理條令 2004年11月12日起實施 衛(wèi)生部第45號令 可感染人類的高致病性菌（毒）種或樣本運輸管 理規(guī)定 2006年2月1日起實行第47頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四相關文件 衛(wèi)生部制定 人間傳染的病原微生物名錄 2006年1月11日起發(fā)布 國際民航組織 危險物品航空安全運輸技術細則 （Doc9284包裝說明PI602） 第48頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四感染性物質定義及分類 感染性物質是那些已知或有理由認為含有 致病原的物質。 國際民航組織危險物品航空安全運輸技術 細則中將感染性

23、物質分為A、B 兩類。 名錄要求：通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨?標準包裝。SFTSV屬于A類標準的感染性物質第49頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四感染性物質的A類包裝 A類：對健康人或動物造成永久性殘疾或致命 疾病的感染性物質。 包裝：最耐用的三層包裝，并附上完整的危險品申報 表。 運輸人員的培訓。 第50頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四感染性物質的A類包裝 航空運輸A類包裝（UN2814號）第51頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四感染性物質的A類包裝 A類包裝 主容器第52頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期

24、四感染性物質的A類包裝 A類包裝 次級容器第53頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四感染性物質的A類包裝 A類包裝 外包裝第54頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四A、B類包裝的異同點 A類、B類包裝的相同點 三層包裝主容器和輔助包裝，都能承受-40至+55 溫度范圍內95kPa的內部壓力而無滲透。完整的包裝必須都能通過危險物品航空安全運輸技術細則規(guī)定的跌落測試。包裝上都有包裝標識、聯(lián)系人、地址等。第55頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四樣本運輸可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒） 種或樣本運輸管理規(guī)定第三條 本規(guī)定適用于可感染人類的高

25、致病性病原微生物菌（毒）種或樣本的運輸管理工作。第四條 運輸?shù)谌龡l規(guī)定的菌（毒）種或樣本，應當經(jīng)省級以上衛(wèi)生行政部門批準。未經(jīng)批準，不得運輸 運輸審批權限： 省內運輸 由省級衛(wèi)生主管部門批準； 省際和國際運輸 由省級衛(wèi)生主管部門初審，報衛(wèi)生部批準。第56頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四樣本運輸?shù)诹鶙l 申請運輸高致病性病原微生物菌（毒）種或樣 本的單位，在運輸前應當向省級衛(wèi)生行政部門提出申請，并提交以下申請材料。 1、病原微生物菌（毒）種或樣本運輸申請表； 2、法人資格證明材料 3、接受單位同意接受證明文件； 4、病原微生物實驗活動資格； 5、取得政府主管部門核發(fā)的從事病原微生物的活動的批準文件； 6、容器或包裝材料的批準文號、合格證書； 7、承諾書； 8、其他材料第57頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四樣本運輸?shù)谄邨l 接收單位應當符合以下條件： （一）具有法人資格； （二）具備從事高致病性病原微生物實驗活動資格的實 驗室； （三）取得有關政府主管部門核發(fā)的從事高致病性病原 微生物實驗活動、菌（毒）種或樣本保藏、生物 制品生產(chǎn)等的批準文件。 第58頁，共69頁，2022年，5月20日，7點7分，星期四樣本運輸?shù)谑粭l 對于為控制傳染病暴發(fā)、流行或者突發(fā)公共 衛(wèi)生事件應急處理的高致病性病原微