反義核酸和核酶

1、第1頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義藥物第2頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四主要內(nèi)容一、反義核酸與反義技術(shù)反義核酸和反義技術(shù)概念反義核酸的基本原理反義核酸的種類反義核酸與反義技術(shù)的應(yīng)用二、核酶技術(shù)及其應(yīng)用核酶概述核酶與RNA修復(fù)核酶技術(shù)在臨床上的應(yīng)用核酶技術(shù)面臨的問題第3頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義核酸和反義技術(shù)反義核酸(antisense nucleic acid) 是一段與靶基因的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通過堿基配對與細(xì)胞內(nèi)核酸特異結(jié)合形成雜交分子，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的

2、表達(dá)，具有合成方便、序列設(shè)計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點反義核酸技術(shù)（antisense nucleic acids technology) 是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計的，以選擇性地抑制特定基因表達(dá)為目的的一類核酸研究新技術(shù) 包括反義RNA(asRNA)、反義DNA(asDNA) 、核酶(Rz)第4頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義核酸的基本原理絕大多數(shù)DNA由兩條堿基互補的單鏈組成，生物信息以核苷酸不同排列順序編碼在DNA鏈上，基因組形成單順反子結(jié)構(gòu)在DNA雙鏈上被轉(zhuǎn)錄為RNA的鏈為正義鏈，與其相對應(yīng)的鏈為反義鏈精心設(shè)計一段寡核苷酸與正義鏈互補，一般由7到3

3、0個核苷酸組成，將會阻斷基因轉(zhuǎn)錄；或?qū)⒑蟹戳x序列的載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，干擾特定基因表達(dá)利用這一原理可以在基因位點、前體mRNA、 mRNA及蛋白水平，通過干擾特定基因功能限制細(xì)胞增殖、分化和凋亡第5頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義基因治療 DNA DNA RNA RNA 反義RNA 阻斷表達(dá) 利用人工合成的反義RNA或DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，控制細(xì)胞的中間階段使編碼蛋白的基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA 或阻斷翻譯相應(yīng)蛋白第6頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第7頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義技術(shù)的兩種技術(shù)路線將表達(dá)與體內(nèi)基因或mR

4、NA互補序列的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)基因互補的mRNA，從而阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)體外合成mRNA互補的核苷酸類似物，通過靜脈注射等途徑進入細(xì)胞，特異性地與目標(biāo)mRNA作用以第二種為主來介紹第8頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義核酸的種類反義RNA：一類能與特異mRNA互補的小分子質(zhì)量的、可擴散的DNA轉(zhuǎn)錄物，能夠從翻譯、轉(zhuǎn)錄和核酸復(fù)制水平上高度特異地抑制靶基因表達(dá)反義DNA：人工合成一小段反義寡核苷酸，與DNA或mRNA序列互補結(jié)合，封閉靶基因表達(dá)（ASODN） 理論上認(rèn)為寡核苷酸與其意義鏈互補，會象“封條”一樣，阻斷mRNA拼接、轉(zhuǎn)錄、翻譯，下調(diào)特定基因表達(dá)第

5、9頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義RNA的最初發(fā)現(xiàn)反義RNA最先發(fā)現(xiàn)于原核細(xì)胞，是由Tomizarna在1981年對質(zhì)粒ColE1復(fù)制的研究過程中發(fā)現(xiàn)的第10頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四c-myc基因真核細(xì)胞中天然反義RNA調(diào)節(jié)c-myc基因是禽類髓細(xì)胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的細(xì)胞同源序列，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)Saito等研究發(fā)現(xiàn)，c-myc基因有3個外顯子，第一個外顯子不編碼蛋白質(zhì)，它的序列與第二個外顯子互補，通過反義RNA與第二個外顯子mRNA的堿基配對而抑制基因表達(dá)在人Burkitt淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)c-myc基因失去了第

6、一個外顯子，從而使c-myc基因表達(dá)失控由此可見，反義RNA的負(fù)調(diào)節(jié)被解除是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的原因之一第11頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四c-myc基因真核細(xì)胞中天然反義RNA調(diào)節(jié)c-myc互補RNAC-MYC第12頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義RNA的作用機制作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū)，阻止mRNA前體的剪接反義RNA與DNA結(jié)合時能阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而阻止特定基因的轉(zhuǎn)錄互補于特定mRNA的非編碼區(qū)，如SD序列或核糖體結(jié)合位點及其上游區(qū)，影響核糖體結(jié)合，從而抑制翻譯互補于特定mRNA的編碼區(qū)，抑制翻譯或激活RNase H使mR

7、NA易被核酸酶降解作用于靶mRNA的5端，阻止帽子結(jié)構(gòu)形成，影響mRNA的成熟作用于PoIy A形成位點，阻止靶mRNA成熟及向胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)運第13頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義RNA的作用機制DNApreRNARNAProteinm7G5pppAAAArRNA第14頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義RNA的獲得途徑化學(xué)會成法：利用核酸合成儀直接合成反義RNA體外轉(zhuǎn)錄法：利用帶有噬菌體SP6或T7等啟動子序列的質(zhì)粒，將特異基因的DNA片段反向插入其多克隆位點中，在RNA聚合酶的作用下體外合成特異性反義RNA細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄法：利用基因重組技術(shù)，在

8、適宜啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之間反向插人一段靶基因，人工構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體(病毒表達(dá)載體或質(zhì)粒表達(dá)載體)，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞并使之在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)反義RNA第15頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義RNA的臨床作用抗病毒：將特定的病毒基因反向插入到表達(dá)性載體中，以構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體再將重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞(病毒宿主細(xì)胞)中表達(dá)特異性反義RNA從而抑制特異有害基因的表達(dá)或抑制病毒復(fù)制（皰疹病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒）抗腫瘤：設(shè)計出針對腫瘤細(xì)胞的癌基因、突變基因、非正常表達(dá)基因及某些腫瘤相關(guān)病毒的癌基因反義RNA以阻斷這些有害基因的表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的第16頁，共78頁

9、，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義DNA與靶基因結(jié)合形式寡核苷酸與雙股DNA結(jié)合，形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，競爭抑制激活轉(zhuǎn)錄蛋白與基因啟動子結(jié)合，發(fā)揮其生物活性寡核苷酸與mRNA雜交形成了核糖核苷酸酶H(RNase H)底物，激活RNase H識別雜交體特異性地剪切雜交分子中的mRNARNase HASODNmRNATFO第17頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四反義寡聚核苷酸與mRNA特異性結(jié)合，阻斷翻譯過程第18頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四ANTISENSE TECHNOLOGIESGENOMICS BASED DRUG DISCOVE

10、RYPHARMACEUTICALSMOLECULAR DIAGNOSTICSGENE THERAPYDRUG DELIVERY SYSTEMSRelation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industry反義技術(shù)與反義核酸的應(yīng)用第19頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四利用反義RNA的原癌基因失活療法： 阻止或抑制原癌基因的過度表達(dá)及抑制癌基因突變體mRNA成熟原癌基因 調(diào)控細(xì)胞生長，增殖與分化 正常情況下，表達(dá)受嚴(yán)格控制 一旦調(diào)節(jié)失控，基因產(chǎn)物（生長因子，生長因子受體，胞

11、內(nèi)外傳遞信 號等癌蛋白）分泌過剩，細(xì)胞惡性增生，致癌 治療方法 根據(jù)已知癌基因的核苷酸序列合成反義RNA 相應(yīng)的反義寡聚核苷酸與腫瘤癌基因活化表達(dá)的mRNA的起始翻譯位 點結(jié)合成RNA/RNA雙鏈體 雙鏈體阻止啟動子與核糖體結(jié)合，或核糖體沿mRNA上移，抑制翻譯反義RNA的應(yīng)用（一）第20頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四 反義RNA的應(yīng)用（二）第21頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四 反義RNA的應(yīng)用（二）第22頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四 反義RNA的應(yīng)用（二）抗HIV-l的作用 ：從翻譯水平封閉基因表達(dá)，并干擾mRN

12、A的剪切、加工而實現(xiàn)抗病毒作用 tat為HIV-l重要的調(diào)節(jié)基因，編碼反式激活因子 Tat蛋白在逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子LTR之后連接反義tat與多聚TAR的構(gòu)建物(LTR-25TAR-AS-TAT) ，具有反義tat及TAR誘餌的雙重作用由于LTR啟動子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的細(xì)胞中得以高表達(dá)將這種外源基因?qū)隡olt-3 T細(xì)胞系、CEM-SS T細(xì)胞系及健康人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，對實驗及臨床分離病毒株均有抑制作用gag是HIV-1的結(jié)構(gòu)基因，編碼p24等病毒結(jié)構(gòu)蛋白Veres等構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)互補于gag區(qū)不同長度的反義RNA(225-122

13、5nt) 在CEM-SS T細(xì)胞及外周血CD4細(xì)胞均有抑制HIV-l復(fù)制的作用長片段反義RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能與不同種的HIV-l RNA結(jié)合而限制了病毒的逃逸 第23頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四部分反義藥物第24頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四針對腫瘤的反義藥物第25頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四針對其他疾病的反義藥物第26頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第一個反義藥物福米韋生Fomivirsen（ISIS2922）是FDA批準(zhǔn)上市的第1個反義藥物商品名Vitravene

14、美國ISIS Pharma公司研制瑞士Ciba Vision Ophthalmics公司申請1998年8月在美國首次上市核苷酸序列為5- GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3硫代磷酸化修飾主要用于治療艾滋病(AIDS)病人并發(fā)的巨細(xì)胞病毒(CMV)性視網(wǎng)膜炎第27頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第一個反義藥物福米韋生1 藥效學(xué)1.1 抗病毒作用機制 主要依賴于反義作用，福米韋生與CMV mRNA特異序列互補結(jié)合，被RNA酶H識別，并使mRNA水解失活 抑制CMV進入宿主細(xì)胞是序列非依賴性的非反義作用1.2 抗病毒活性 對人類CMV病毒株AD169的EC50為0

15、.37moL 此EC50為更昔洛韋（ganciclovir）的l301901.3 耐藥性 耐受高濃度福米韋生的病毒突變株與福米韋生互補的基因區(qū)并無改變，這表明耐藥性不是互補基因區(qū)發(fā)生改變而引起的第28頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第一個反義藥物福米韋生2 藥動學(xué)2.1 兔體內(nèi)藥動學(xué)以14C標(biāo)記的福米韋生單次66g劑量，玻璃體液中消除t1/2為62h給藥10天后，仍對CMV復(fù)制有抑制作用，有22%的福米韋生存在，其余78%則降解為短鏈代謝物視網(wǎng)膜中消除t1/2約為79h2.2 猴體內(nèi)藥動學(xué)玻璃體液藥物濃度與劑量曲線幾乎為直線關(guān)系峰值濃度出現(xiàn)在給藥23天后，14天后基本檢

16、測不到在每周或每2周玻璃體內(nèi)注入11、57和115g后，玻璃體液中未發(fā)現(xiàn)藥物累積現(xiàn)象但多次注射后，視網(wǎng)膜上出現(xiàn)藥物累積現(xiàn)象福米韋生115g單次給藥，在視網(wǎng)膜中消除t1/2為78h第29頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第一個反義藥物福米韋生3 臨床療效前3周每周福米韋生165g玻璃體內(nèi)注射，以后每2周給藥1次，用藥組和對照組病情進展時間中位數(shù)分別為71和14天福米韋生可以降低病人體內(nèi)的CMV活性，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系病情發(fā)展到威脅視力的病人，使用福米韋生后癥狀有所好轉(zhuǎn)，病情進展明顯延緩4 不良反應(yīng)最常見不良反應(yīng)是暫時性眼內(nèi)壓升高和輕、中度眼前、后房炎癥反應(yīng)所有研究對象均未發(fā)生

17、視網(wǎng)膜剝脫和全身毒性反應(yīng)高劑量可引起少數(shù)病人外周視網(wǎng)膜色素沉著及周邊視力下降與眼外科手術(shù)相比，玻璃體內(nèi)注射發(fā)生出血、眼內(nèi)炎和視網(wǎng)膜剝脫的風(fēng)險要小得多第30頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第一個反義藥物福米韋生5 適應(yīng)證和禁忌證福米韋生為二線治療藥物，適用于對其他治療措施不能耐受或沒有效果或有禁忌的病人；禁用于24周內(nèi)使用西多福韋（cidofovir）治療的病人，以免增加發(fā)生眼內(nèi)炎的危險性6 與治療CMV視網(wǎng)膜炎的其他藥物比較更昔洛韋、西多福韋和膦甲酸鈉是CMV抑制劑，而非殺死劑；具有交叉耐藥性；可產(chǎn)生腎毒性；插管給藥、植入制劑費用昂貴、重復(fù)手術(shù)以及視網(wǎng)膜剝脫發(fā)生率高（2

18、8%）使應(yīng)用受限福米韋生具有阻止病毒復(fù)制，療效持久、用藥次數(shù)少，不良反應(yīng)少而輕，局部玻璃體內(nèi)注射給藥優(yōu)于其他上述提及的給藥方法7 展望第31頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移技術(shù)受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)運技術(shù)的啟發(fā)實現(xiàn)DNA和RNA的轉(zhuǎn)運例：脫唾液酸血清類粘蛋白(ASGP)受體 唾液酸血清類粘蛋白 唾液酸 ASGP ASGP + PL （多聚賴氨酸） ASGP-PL復(fù)合物 反義RNA + ASGP-PL復(fù)合物 ASGP-PL-反義RNA復(fù)合物 ASGP-PL-反義RNA復(fù)合物 肝細(xì)胞表面ASGP受體識別 吞噬 釋放 發(fā)揮作用優(yōu)點：專一性強，抗降解能力強第32頁，共7

19、8頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四以聚合物微球為載體的輸送系統(tǒng) 目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羥乙酸（LA-GA）以丙交酯和乙交酯為單體形成的共聚物，降解屬于水解反應(yīng)產(chǎn)物均為人體正常代謝物，降解時間取決于兩種單體的配比和聚合物的分子量構(gòu)成的結(jié)合復(fù)合體具有潛在的轉(zhuǎn)運反義核苷酸和核酶的作用 第33頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四核酶技術(shù)及其應(yīng)用核酶(Ribozyme) 一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列，具有解離后重復(fù)切割相同靶分子的能力第34頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四核酶發(fā)展簡史1968年

20、，F(xiàn)rancis Crick在他的論文“基因密碼的起源”一文中提到：“可能第一個酶是具有復(fù)制能力的RNA” ，沒有人予以注意1987年，第52屆冷泉港定量生物學(xué)國際討論會上，Alan Weiner做會議總結(jié)時重復(fù)了20年前Francis Crick的話，會議注意力已集中到最近發(fā)現(xiàn)的具有酶活性RNA分子上1989年，諾貝爾化學(xué)獎授予了分別獨立地發(fā)現(xiàn)具有酶活性的RNA分子的Thomas. R. Cech（Colorado University） Sidney Altman（Yale University）第35頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四Thomas R. Cech切赫

21、，美國人因發(fā)現(xiàn)RNA生物催化作用與S. Altman同獲1989年諾貝爾化學(xué)獎獨立發(fā)現(xiàn)RNA不僅被動地傳遞遺傳信息，還能催化細(xì)胞內(nèi)生命所必需的化學(xué)反應(yīng)，1982年公布其研究結(jié)果，1983年證實RNA的酶活動此前，人們認(rèn)為僅蛋白質(zhì)才能起酶的作用第36頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四核酶的發(fā)現(xiàn)研究目的：rRNA中一些無意義的序列，或內(nèi)含子(intron)，如何從RNA分子中剪切下來？研究對象：原生動物四膜蟲(Tetrahymena Thermophila)，只含一種RNA，除rRNA外還有一個由413個核苷酸組成的插入序列(interveningsequenc，IVS)研究

22、發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物rRNA前體很不穩(wěn)定，在鳥苷和Mg2+存在下切除自身的IVS，使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。催化反應(yīng)是在無任何蛋白質(zhì)酶存在下發(fā)生的，稱為自我剪接研究結(jié)論： IVS具有類似蛋白酶的功能，能夠打斷及重建磷酸二脂鍵 rRNA前體能靠自己完成剪接過程，在一定條件下按一定方式盤繞，進而切割自己，以后再把保留部分連接起來?？梢源呋杂傻孜锏木哂忻富钚缘腞NA RNA分子具有自身斷裂的催化作用，以及酶活性的另一個重要方面即催化其他分子的反應(yīng)第37頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四Sidney Altman 奧爾特曼（1939） 美國人因發(fā)現(xiàn)RNA的生物催化

23、作用而獲1989年諾貝爾化學(xué)獎1978年奧爾特曼發(fā)現(xiàn)了核糖核酸(RNA)自身具有的生物催化作用不僅為探索RNA的復(fù)制能力提供了線索，而且說明了最早的生命物質(zhì)是同時具有生物催化功能和遺傳功能的RNA，打破了蛋白質(zhì)是生物起源的定論第38頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四S.Altman的研究工作研究目的：t-RNA分子的剪接過程 研究發(fā)現(xiàn)：在較高濃度的鎂離子和適量精氨酸參與下，核酸酶P（ribonuclease P， RNase P ）中 RNA能夠切割tRNA前體5端 研究結(jié)論：過去都認(rèn)為RNase P的催化作用由RNA和蛋白質(zhì)共同完成的，而該實驗證明， RNase P的催

24、化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)僅僅起穩(wěn)定構(gòu)象的作用由于這類酶具有類似核糖核酸功能，而化學(xué)本質(zhì)為核酸，因此被切赫稱之為核酶第39頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四核酶的作用機制 第40頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四核酶的分類剪切型核酶：這類核酶催化自身或者異體RNA的切割，相當(dāng)于核酸內(nèi)切酶剪接型核酶：這類核酶具有核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種活性剪切型核酶剪接型核酶根據(jù)催化反應(yīng)錘頭核酶I型內(nèi)含子II型內(nèi)含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒(HDV)核酶RNase P鏈孢霉線粒體(VS)核酶自體催化異體催化第41頁，共78頁，2022年，5月20日，2點

25、52分，星期四自體剪切型核酶-錘頭型核酶錘頭核酶是從類病毒中分離出來的本來是一個順式切割的酶，將其分為酶鏈和底物鏈兩部分后就轉(zhuǎn)變?yōu)榘袠?biāo)特異性的反式切割的酶在防止有害基因的表達(dá)上具有很大的應(yīng)用價值形狀：長約30個核苷酸，呈球狀構(gòu)象，可粗略看成性折疊二級結(jié)構(gòu)：3個超螺旋結(jié)構(gòu)域和13個保守核苷酸殘基構(gòu)成：催化區(qū)和底物結(jié)合區(qū)性質(zhì)：需要二價金屬離子(Mg2+)作為它的輔因子，核酶的活性形式是一種RNA鍵合金屬氫氧化物第42頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四3個雙螺旋區(qū)13個核苷酸殘基保守序列剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3端自動發(fā)生第43頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52

26、分，星期四發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酶1989年漢普（Hample）研究煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）的負(fù)鏈RNA的自我剪切反應(yīng)，提出發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structure）模型發(fā)夾核酶催化機制：金屬離子在催化反應(yīng)中起結(jié)構(gòu)作用，其剪切活性比錘頭結(jié)構(gòu)核酶高第44頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四53剪切位點自體剪切型核酶-發(fā)夾結(jié)構(gòu)3個環(huán)和4個螺旋形成兩個結(jié)構(gòu)域剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識別序列GUC的5端兩個內(nèi)部環(huán)中的堿基及在螺旋區(qū)II的G11和底物中的G+1都是酶發(fā)揮作用所必需的第45頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四肝炎病毒（HDV）核酶目前唯一一種哺乳動物細(xì)胞內(nèi)具有天

27、然核酶活性的動物病毒來源于肝炎病毒的反義RNA和基因組RNA，為單股環(huán)狀負(fù)鏈RNA病毒結(jié)構(gòu)特點：有3個由堿基配對形成的莖，剪切時需要二價陽離子參與，結(jié)果產(chǎn)生5-OH和 2, 3-環(huán)磷酸第46頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四剪切部位剪切部位自體剪切型核酶-斧頭結(jié)構(gòu)三個堿基對的莖需要二價陽離子產(chǎn)生5-OH和 2,3-環(huán)磷酸第47頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四鏈孢霉線粒體（VS）核酶VS核酶球狀，由5個螺旋結(jié)構(gòu)組成，這些螺旋結(jié)構(gòu)通過兩個連接域連接起來，連接域?qū)τ诖呋磻?yīng)很重要第48頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四異體剪切型核酶

28、RNase PRNase P是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端RNase P由M1 RNA和蛋白質(zhì)亞基組成體外： M1 RNA具催化作用，蛋白質(zhì)作為輔助因子 體內(nèi)： M1 RNA和蛋白質(zhì)對酶活性都是必需的RNase P可剪切前體5端41nt, 5端成熟不同tRNA的 5 端沒有順序共同性，剪切的準(zhǔn)確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關(guān)，表明在RNase P的組分內(nèi)沒有引導(dǎo)序列， RNase P所識別的是底物的高級結(jié)構(gòu)第49頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四剪切位點第50頁，共78頁，2022年，5月

29、20日，2點52分，星期四G結(jié)合位點保守序列剪接部位引導(dǎo)序列G結(jié)合位點 I類內(nèi)含子二級結(jié)構(gòu)通式第51頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第52頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四型內(nèi)含子核酶一類具有酶催化功能的內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄成RNA后，可以自剪接其轉(zhuǎn)錄后可形成9個堿基配對形成的特定二級結(jié)構(gòu)，分別命名為P1至P9在剪接反應(yīng)中，需要游離的鳥苷作輔助因子可以用來修復(fù)體內(nèi)的有害突變基因第53頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四I型內(nèi)含子催化其他RNA分子反應(yīng)的幾種類型 轉(zhuǎn)核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC + CpCpCp

30、C 水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC 轉(zhuǎn)磷酸作用 CpCpCpCpCpCp + UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi 限制性內(nèi)切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU + GpN第54頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四II型內(nèi)含子核酶由6個螺旋組成，分成3個部分：邊界序列5 GUGCG YnAG，（Y代表嘧啶，n代表任意核苷酸）3莖環(huán)結(jié)構(gòu)分支點順序 A處于未配對狀態(tài)，有一游離的2-OH剪接機制：不需要鳥苷或鳥苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg 2+)第55頁，共78頁

31、，2022年，5月20日，2點52分，星期四II型內(nèi)含子核酶II型內(nèi)含子有一個保守的二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域V：高度保守，催化活性必需結(jié)構(gòu)域VI：未配對的A 提供2-OH第56頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四II型內(nèi)含子核酶第57頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四II型內(nèi)含子核酶剪接機制第58頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第59頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四脫氧核酶指具有催化功能的 DNA分子稱為脫氧核酶 (DNAzyme)，又稱酶性DNA在一定條件下可切割RNA分子特定位點內(nèi)部的磷酸二酯鍵脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)進

32、一步延伸了酶的概念具有水解酶活性的脫氧核酶 以RNA為底物的脫氧核酶：包括“10-23” DRz和“8-17” DRz 以DNA為底物的脫氧核酶：手槍型脫氧核酶具有N-糖基化酶活性的脫氧核酶具有連接酶活性的脫氧核酶具有激酶活性的脫氧核酶第60頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四10-23型脫氧核酶作用機理第61頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四手槍型脫氧核酶自我剪切作用機理第62頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四核酶與RNA修復(fù)核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特異性地催化RNA剪接經(jīng)過基因工程改造的核酶，可以位點特異性地切

33、割任意給定的RNA分子剪接有兩種形式：一是分子內(nèi)不同部分間的剪接，稱為順式剪接；一是不同分子間的剪接，稱為反式剪接反式剪接是修復(fù)RNA外顯子突變的重要方法可以把正常基因或具有類似功能的基因相應(yīng)片段，剪接到異常RNA上去，換下突變的部分第63頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四修復(fù)RNA結(jié)構(gòu)缺陷 利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修復(fù)已有的基因缺陷N. Lan等對鐮形細(xì)胞貧血突變的珠蛋白mRNA進行了修復(fù) 鐮刀形細(xì)胞貧血是由于珠蛋白基因第6密碼子中的一個AT突變引起的將來源于四膜蟲組I內(nèi)含子的核酶改造，使之能專一性識別珠蛋白mRNA突變位點上游的特定序列將珠蛋白cDNA

34、下游包括外顯子在內(nèi)的對應(yīng)片段連接到這一核酶的3端轉(zhuǎn)染培養(yǎng)到病人外周血和臍帶血干細(xì)胞后，均檢測到珠蛋白mRNA被剪接成珠蛋白融合RNA分子，說明引入的功能基因得到表達(dá)第64頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四第65頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四胎兒型血紅蛋白(HbF，22)與成人型血紅蛋白(HbA，22)功能相近，所以珠蛋白的引入，可以代償S珠蛋白所喪失的功能，起到治療鐮形細(xì)胞貧血的作用T第66頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四恢復(fù)正常剪接途徑基因突變有時會在內(nèi)含子中生成新的剪接點，當(dāng)然也是異常的剪接點。它們與左鄰右舍原來不起作

35、用的隱匿的剪接點搭配起來，就會形成錯誤剪接由于原有的正常剪接點并未喪失功能，只是作用被異常剪接抑制，所以用反義核酸通過堿基互補，封閉異常剪接點或其他剪接元件，就可堵住異常剪接途徑，迫使剪接系統(tǒng)選擇正確的途徑，形成正常RNA。這就間接地對RNA缺陷作了“修復(fù)”剪接缺陷型突變往往使mRNA失活，影響嚴(yán)重 地中海貧血是由于患者珠蛋白基因突變，導(dǎo)致正常鏈減少，紅細(xì)胞內(nèi)和鏈不平衡，締合形成的成人型血紅蛋白（22）少了或者完全沒有引起的 已發(fā)現(xiàn)的190多種地中海貧血突變型中，有一部分屬于剪接缺陷型 第67頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四CCCCCCCCCC反義RNA第68頁，共78

36、頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四地中海貧血我國常見的內(nèi)含子2第654位CT 突變（654），就是在653位形成了一個新的剪接點，同時又激活了其上游579位一個潛在的剪接點，導(dǎo)致一段長度為73個堿基的內(nèi)含子2序列插入到外顯子2和3之間，形成異常mRNA，引起地中海貧血表型由于突變基因原有的正常剪接點并未遭到破壞，仍然可以發(fā)揮作用，所以用反義核酸封閉異常的653或579位點，就能迫使人體剪接系統(tǒng)回到正常剪接途徑，減少異常mRNA的形成反義封閉雖沒有對珠蛋白基因的突變作任何修正，但是對突變RNA的錯誤剪接方式作了糾正，所產(chǎn)生的成熟mRNA可以指導(dǎo)合成正常珠蛋白鏈。第69頁，共78頁，2

37、022年，5月20日，2點52分，星期四調(diào)整蛋白質(zhì)肽鏈比例 突變基因的異常表達(dá)，往往擾亂體內(nèi)蛋白質(zhì)肽鏈之間的平衡，引起疾病反義封閉技術(shù)也可用來糾正基因表達(dá)的紊亂。常見的血紅蛋白H?。匀苎载氀┑难芯浚褪且粋€比較理想的范例正常人每個細(xì)胞有4個珠蛋白基因，2個珠蛋白基因，合成的和鏈正好締合成四聚體22第70頁，共78頁，2022年，5月20日，2點52分，星期四血紅蛋白H病如果在4個珠蛋白基因中只有1個正常，其余3個丟失或有缺陷，則紅細(xì)胞中鏈合成不足，鏈相對過剩。多余的鏈自行聚合為四聚體4，即血紅蛋白H血紅蛋白H不穩(wěn)定，容易解體生成游離的鏈，游離鏈在紅細(xì)胞內(nèi)沉淀形成H包涵體，附著在紅細(xì)胞膜上，使膜受損失去柔韌性。這種紅細(xì)胞易被脾臟破壞，導(dǎo)致血紅蛋白H病血紅蛋白H病的基本病因是鏈偏少，鏈偏多，可以采用反義封閉表達(dá)偏多的正常 mRNA，使鏈合成減少，與本身不足的鏈在低水平上達(dá)成平衡，從而改善臨床癥狀這一策略反其道而行