CTAB法提取植物DNA課件

1、目的要求:掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)三： CTAB法提取植物DNA實(shí)驗(yàn)原理1、在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在；在制備核酸時，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。2、在濃氯化鈉溶液(12molL)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很??；而在稀氯化鈉溶液(0.14molL)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。3、進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去，常采用的

2、去除蛋白：用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積95乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級沉淀時即被除去。在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.011.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過

3、酸過堿。物理因素，DNA分子鏈很長，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性。又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會令DNA分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時被釋放出來，它會降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。操作過程最好在低溫(0左右)下進(jìn)行。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時可使核酸酶被破壞而失活。CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中

4、沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。1、Tris-HCl (pH8.0)提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；3、NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解于液相；4、CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； 5、-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效

5、去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。 CTAB分離緩沖液2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA（PH8.0), 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巰基乙醇100mL： 2gCTAB，8.18g NaCL，0.74gEDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0), 0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。 操作方法：將CTAB分離緩沖液置于60水浴中預(yù)熱；稱取1.5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快研碎；取0.1g粉末直接加入1.5ml的EP管中，加人500ul預(yù)

6、熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動使之混勻；樣品于65保溫30分鐘；加等體積的酚-氯仿-異戊醇抽提（顛倒混勻10次以上）；室溫下12000rpm離心10分鐘；小心取上清置于一個新的EP管中（盡量避免吸取中間層）,加入2倍體積的無水乙醇（或2/3體積的異丙醇）,輕輕混勻，-20 10min,使核酸沉淀下來；14000rpm離心10分鐘,小心倒去上清液; 1ml 70%乙醇洗滌沉淀2次；在室溫下使DNA沉淀干燥；將DNA沉淀溶于2ul ddH2O,-20保存?zhèn)溆谩?取5DNA溶液做0.7%的瓊脂糖電泳，檢查DNA的大小和質(zhì)量注意；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。 1、用酚抽提細(xì)胞DNA時，有什么作

7、用？ 使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 使用酚的優(yōu)點(diǎn)：1.有效變性蛋白質(zhì)；2抑制了DNase的降解作用。缺點(diǎn)：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。 所以提取RNA時只用氯仿抽提。思考題：電泳技術(shù)的基本原理介紹電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。 帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。即使兩個分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。瓊脂糖凝膠電泳原理：瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D-半乳糖和3,6脫水L-半乳糖連接而成的一種線性