分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用課件

1、分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用遺傳標(biāo)記（ ）具有多型性易于鑒別與目標(biāo)基因緊密連鎖 性狀標(biāo)記 色澤， 形態(tài) 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 倒位，易位，帶 生化標(biāo)記 同功酶 分子標(biāo)記 、 基礎(chǔ)-基因表達(dá)結(jié)果表現(xiàn)型堿基序列變異遺傳標(biāo)記 性狀標(biāo)記基礎(chǔ)-堿基形態(tài)標(biāo)記遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。如穗形、芒長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。特點(diǎn)：直觀簡(jiǎn)單從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個(gè)體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時(shí)難以反映基因型差異。 形態(tài)標(biāo)記遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨

2、體、著絲點(diǎn)位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）。隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。特點(diǎn)：直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、生化標(biāo)記貯藏蛋白和同工酶貯藏蛋白同工酶特點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。生化標(biāo)記貯藏蛋白和同工酶貯藏蛋白分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達(dá)與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異； （3）數(shù)量豐富，多

3、態(tài)性遍及整個(gè)基因組；（4）表現(xiàn)為“中性”，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖；（5）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：分子標(biāo)記的分類（等1996）分子標(biāo)記以Southern為基礎(chǔ)如RFLP以PCR為基礎(chǔ)單引物PCR標(biāo)記 有RAPD、 AP-PCR、DAF、ISSR等雙引物選擇性擴(kuò)增PCR 主要指AFLP需克隆、測(cè)序構(gòu)建特殊雙引物PCR標(biāo)記如SSR、STS等分子標(biāo)記的分類（等1996）分子標(biāo)記以Southern為基礎(chǔ)植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記 (, ) 植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記 原理： 限制性內(nèi)切酶酶切 電

4、泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小原理： 酶切：3-5 ，以10U內(nèi)切酶酶切5小時(shí) 電泳：0.6-0.8%瓊脂糖膠70V電泳16小時(shí) 染色：染色20分鐘 變性：0.25M 20分鐘，抽真空，水冼印跡：加入0.4N ，進(jìn)行 印跡沖洗：以2 冼膠，風(fēng)干酶切電泳印跡酶切：3-5 ，以10U內(nèi)切酶酶切5小時(shí) 酶切電泳印跡雜交洗脫預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5 、）中， 封好后置65溫箱中振蕩56小時(shí)。雜交：預(yù)雜交液中加入標(biāo)記好的和探針，放入雜交膜浸勻。封好雜交盒后，置65溫箱中振蕩過夜。洗脫：將膜轉(zhuǎn)入洗脫盒，加入洗脫液65 振蕩洗脫兩

5、次（15次），吸干包好。雜交洗脫預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5 、）中放射自顯影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上, 于暗室中將 光片放于雜交膜上， 再放上另一張?jiān)龈衅?，裝人暗袋，并用夾板夾好。置-70超低溫冰箱中曝光10天左右。使用磷屏儀，操作更方便。放射自顯影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上, 于暗室中將 光片探針來源：探針與基因組（）探針探針:保守性較強(qiáng)，探針檢測(cè)的多態(tài)性頻率較低。探針:檢測(cè)的多態(tài)性頻率較高，但不同種屬特異性較強(qiáng)。玉米探針：. 探針來源：探針與基因組（）探針探針標(biāo)記隨機(jī)引物法25 變性 5 寡聚核苷酸2 3 -32P 2 酶加水至50，37溫箱中標(biāo)記2小時(shí)探針標(biāo)記隨機(jī)引物法2

6、5 變性 標(biāo)記特點(diǎn)共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)某些植物中開發(fā)探針已遍及整個(gè)基因組缺點(diǎn)：需要量較大，技術(shù)復(fù)雜； 用于做圖較費(fèi)時(shí)，難以分析大量樣品； 在基因組較大、嚴(yán)格自花授粉作物上多態(tài)性很低，使遺傳圖飽和度低。標(biāo)記特點(diǎn)共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型原理：用一個(gè)隨機(jī)引物（8-10）、堿基隨機(jī)排列的寡核苷酸序列，非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組，然后電泳分開擴(kuò)增片段。原理： 3553Target DNA sequenceGCTCGCAGTACTdenature 95 C5335GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCanneal primers 60 CTaq

7、polymerase binds 3 and extendsGCTCGC5335AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGC Repeat 25-40 times 3553Target DNA sequenceG的操作反應(yīng)： （20l）1l 15 102.0l 2+（25）1.2l 酶（5l）0.15l （25）0.2l加水至20l，再加入石臘油，進(jìn)行擴(kuò)增的操作反應(yīng)：1 95 2分鐘2 95 15秒3 36 30秒4 72 45秒5 2 46循環(huán)6 72 5分鐘 擴(kuò)增：1 95 2分鐘擴(kuò)增：主要特點(diǎn)無需雜交，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；需要量少，引物便宜，成本較低；技術(shù)簡(jiǎn)便，操

8、作方便、快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。不同物種間引物通用； 缺點(diǎn)：大多顯性遺傳，不能鑒別雜合和純合子；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。主要特點(diǎn)無需雜交，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；( )：與不同的是:引物濃度更高，引物長(zhǎng)度更短（一般58個(gè)堿基），且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型，譜帶信息比大得多。 （等，1990）( )：與不同的是:( )引物較長(zhǎng)（1050）；引物濃度較高；引物長(zhǎng)度不定，并且常常來自為其它目的而設(shè)計(jì)的引物（如M13通用測(cè)序引物）。( )引物較長(zhǎng)（1050）；分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用課件共同優(yōu)點(diǎn)： 在不需要知道所擴(kuò)增序列情況下，產(chǎn)生片段

9、的指紋； 需量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。缺點(diǎn)： 對(duì)反應(yīng)條件非常敏感，重復(fù)性差。共同優(yōu)點(diǎn)：（ ）為提高標(biāo)記穩(wěn)定性，把目標(biāo)片段克隆測(cè)序，根據(jù)片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（通常24個(gè)堿基），再進(jìn)行擴(kuò)增，可把相應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來。具有更高的可重復(fù)性共顯性（ ）為提高標(biāo)記穩(wěn)定性，把目標(biāo)片段克隆測(cè)序，根據(jù)片段兩微衛(wèi)星標(biāo)記()真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布,大約每隔10-50就存在一個(gè).哺乳動(dòng)物中約為植物的5-6倍;植物中平均23.3有一個(gè);雙子葉植物數(shù)量大于單子葉植物,核 數(shù)量多于細(xì)胞質(zhì);根據(jù)核心序列堿基數(shù)的不同,可分為單堿基、2堿基、3堿基、4堿基等多種重復(fù)型。微衛(wèi)星標(biāo)記()真核生物基因組普遍存在，呈隨

10、機(jī)分布,大約每隔1不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。通過對(duì)54個(gè)植物種核和28個(gè)植物種細(xì)胞器 (1-4)的搜索,發(fā)現(xiàn)：()最豐富,然后依次是: (A)n、(T)n、()n、()n、()n、()n、()n、()n、()n、()n、()n、() n、()n、()n、()n、()n及()n、()n。同一類內(nèi)堿基種類不同的,豐度差別很大。的分布特點(diǎn)不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。的分布特點(diǎn)的功能長(zhǎng)期以來一直認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒有明確的生理功能。但隨著研究深入，證明并非如此。的主要功能:編碼氨基酸；染色體末端的，有保護(hù)完整性、避免降解、融合及丟失的功能；提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率；基因重組的熱點(diǎn)

11、，是基因變異的來源；部分可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物或活化染色體的功能長(zhǎng)期以來一直認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒有明確的生理功能。但隨著兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過將其間微衛(wèi)星序列擴(kuò)增出來，利用電泳技術(shù)獲得長(zhǎng)度多態(tài)性。不同材料重復(fù)次數(shù)的不同，導(dǎo)致了長(zhǎng)度的高度變異性。分析兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建探針制備-預(yù)雜交-帶有克隆的選擇測(cè)序引物設(shè)計(jì)檢測(cè)其它方法: 、相關(guān)種間. .分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建 % (N) % (N) 89.8 (521)78.3 (299) 76.4 (1800) 86.0 (773)

12、45.4 (403)50.4 (141) 35.2 (1683) 58.4 (363) 的操作反應(yīng)：（20l）4l（1）0.25l102.0l2+（25）1.2l酶（5l）0.1l（25）0.2l加水至20l的操作反應(yīng)：混合后，進(jìn)行擴(kuò)增：1 95 2分鐘2 95 30秒3 56 30秒4 72 60秒5 2 31循環(huán)注：引物退火溫度在52-65 不等。混合后，進(jìn)行擴(kuò)增：的特點(diǎn)：兩側(cè)順序保守，在同種間多相同；數(shù)量豐富，在整個(gè)基因組均勻隨機(jī)分布；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；多數(shù)增減重復(fù)序列頻率高，在品種間具廣泛位點(diǎn)變異；共顯性標(biāo)記，可鑒別雜合子和純合子；僅需微量組織，適合分析半自動(dòng)化的特點(diǎn)：兩側(cè)順序保

13、守，在同種間多相同；相對(duì)的物種專一性；由于開發(fā)時(shí)需針對(duì)每個(gè)座位的微衛(wèi)星序列，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，需建立基因文庫(kù)、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過程，開發(fā)困難，費(fèi)用較高，耗時(shí)長(zhǎng)；實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)；不同引物退火溫度不同，需要探索。不足：不足：的檢測(cè)瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)一般采用銀染、熒光檢測(cè)。的檢測(cè)瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）銀染檢測(cè)程序脫色：加1升10液，脫色20分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板2次，每次5分鐘染色：加染色液(13，0.075%甲醛)30分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板不超過5秒鐘；顯影：預(yù)冷顯影液（303，0.075%甲醛，0.423），輕搖到帶紋出現(xiàn)；定影

14、：在固定/停止液并輕搖3-5分鐘；沖洗：用重蒸水沖洗2次，每次2分鐘；干膠：室溫下自然干燥過夜。銀染檢測(cè)程序脫色：加1升10液，脫色20分鐘（ )原理：基于技術(shù)和技術(shù)的結(jié)合 （ )原理： 片段環(huán)化，不利小片段擴(kuò)增； 引物的退火溫度高； 片段優(yōu)先擴(kuò)增酶切連接酶切連接接頭序列 接頭、 分別為： 53 35： 53 35： 53 35 接頭序列 接頭、 分別為：M00:53；P00:5- 3;E00:53; +3: 53 +3: 53 +3: 53M00:53； 技術(shù)的特點(diǎn)（1）由于內(nèi)切酶及選擇性堿基組合數(shù)和種類很多，產(chǎn)生標(biāo)記數(shù)無限，可覆蓋整個(gè)基因組。（2）多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它分子標(biāo)記，一般可檢測(cè)到5

15、0-100個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠在遺傳關(guān)系十分相近的材料產(chǎn)生多態(tài)性，被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)。（3）分析由于擴(kuò)增片段較短（30-700)，分辨率高。 技術(shù)的特點(diǎn)（1）由于內(nèi)切酶及選擇性堿基組合數(shù)和種類很多，產(chǎn)（4）分析用樣量少（0.05-0.5 g ），而且對(duì)模板濃度的變化不敏感。（5）由于特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，因而假陽(yáng)性低，可靠性高。（6）引物在不同物種間是通用的，可用于沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種。（7）銀染技術(shù)具有快速、方便的特點(diǎn)，在1-2天內(nèi)可以得到指紋。（4）分析用樣量少（0.05-0.5 g ），而且對(duì)模板濃操作具體包括三個(gè)步驟：1. 酶切連接；2. 擴(kuò)增，使

16、目的序列擴(kuò)增到0.51g；3. 電泳分離（利用聚丙烯酰胺凝膠）。對(duì)于基因組較大的物種，需要進(jìn)行兩步擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。操作步驟：操作具體包括三個(gè)步驟：操作步驟：模板的酶切與連接（200l）2.5l3單位 3單位 接頭（50 l） 1.0l 接頭（5 l） 1.0l10 2.5l100 0.25l（10） 2.0lT4-連接酶（3l） 0.4l加水至25l，37酶切-連接4-6小時(shí)，或過夜。 實(shí)驗(yàn)程序模板的酶切與連接（200l）2.5l 實(shí)驗(yàn)程序片段的預(yù)擴(kuò)增取2.0l完成的樣品，加入18l如下混合液： 引物（M00，50l）0.6l 引物（P00，50l） 0.6l 10 2.0l 2+（2

17、5） 1.2l 酶（5l） 0.1l （25） 0.16l加2O至20l片段的預(yù)擴(kuò)增取2.0l完成的樣品，加入18l如下混合液：混合后，在如下條件下擴(kuò)增： 195 2分鐘 295 30秒 356 30秒 472 60秒 5 2 31 6 72 5分鐘混合后，在如下條件下擴(kuò)增：的選擇性擴(kuò)增取4l稀釋預(yù)擴(kuò)增液，加入16l如下反應(yīng)液：引物（50l） 0.8l引物（50l） 0.8l10 2.0l2+（30） 1.1l（25） 0.18l酶（5l） 0.12l2O 11.0l的選擇性擴(kuò)增取4l稀釋預(yù)擴(kuò)增液，加入16l如下反應(yīng)液：混合后按如下程序擴(kuò)增： 195 2分鐘 295 30秒 365 30秒（-

18、0.7） 472 60秒 5 2 12循環(huán) 695 30秒 756 30秒 872 60秒 9 6 30 10 72 5分鐘混合后按如下程序擴(kuò)增：的檢測(cè)銀染熒光同位素檢測(cè)的檢測(cè)銀染注意事項(xiàng)：1酶切反應(yīng)對(duì)模板質(zhì)量要求較高，要求260/280 在1.8左右，且不能有降解。2反應(yīng)對(duì)模板濃度不是很敏感，在5050時(shí)，均可以觀察到多態(tài)性帶，但為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，濃度不能太低。3酶切-連接反應(yīng)可以分開作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。注意事項(xiàng)：1酶切反應(yīng)對(duì)模板質(zhì)量要求較高，要求260/2804反應(yīng)對(duì)要求較高，要首先摸索優(yōu)化2+、條件，達(dá)到最佳擴(kuò)增。5受甲基化胞嘧啶的影響較小，而對(duì)富含的甲基化胞嘧啶十

19、分敏感，因而檢測(cè)的多為表達(dá)區(qū)域，而檢測(cè)位點(diǎn)聚集在甲基化較高的重復(fù)序列區(qū)域。4反應(yīng)對(duì)要求較高，要首先摸索優(yōu)化2+、條件，達(dá)到最佳擴(kuò)增。6引物中用作選擇性核苷酸的和含量對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目有影響。一般而言，和含量越高，擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目越少。7 同位素、熒光標(biāo)記分辨率較高，但價(jià)格昂貴，操作不方便；銀染方法方便快捷，掌握好各個(gè)環(huán)節(jié)，同樣可以達(dá)到很好的效果。6引物中用作選擇性核苷酸的和含量對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目有影為什么用雙酶解?適合擴(kuò)增效率與變性膠的分辨率減少擴(kuò)增的片段,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目使標(biāo)記單鏈成為可能增加擴(kuò)增的靈活性增加使用引物的靈活性為什么用雙酶解?適合擴(kuò)增效率與變性膠的分辨率為什么要預(yù)擴(kuò)

20、增?減少選擇性堿基的錯(cuò)配減輕背景提供足量模板降低模板濃度的影響為什么要預(yù)擴(kuò)增?減少選擇性堿基的錯(cuò)配目的：分子標(biāo)記輔助選擇 ()篩選文庫(kù)，進(jìn)行圖位克?。?） 目的： PIC/Simpson遺傳多樣性系數(shù) = 1 - Pi 2等位基因數(shù)目 A A = 4PIC = 1 SUM (0.47)2 + (0.30)2 + (0.17)2 + (0.04)2 = 0.64SSR資料：PIC/Simpson遺傳多樣性系數(shù) = 1 - Pi 遺傳相似系數(shù) (1985): a + da + b + c + d簡(jiǎn)單匹配系數(shù)（SM）(Simple matching coefficient) a a + b + cJ

21、accard 相似系數(shù)(Jaccard 1908). 2a2a + b + cDice (1945)相似系數(shù)，即 Nei & Li (1979)相似系數(shù).遺傳相似系數(shù) (1985): a + d簡(jiǎn)單匹配其中 :abcd+ -+-kj其中 :abcd+ -+-kj遺傳距離的計(jì)算：（1972）（ （1978）遺傳距離的計(jì)算：（1972）（ （1978）兩個(gè) 隨機(jī)群體 j 、k間的遺傳距離（ 1972）: 為X群體第i個(gè)位點(diǎn)第j個(gè)等位基因頻率 為Y群體第i個(gè)位點(diǎn)第j個(gè)位點(diǎn)基因頻率 兩個(gè) 隨機(jī)群體 j 、k間的遺傳距離（ 1972）: 為X在種質(zhì)資源研究中，大多數(shù)采用羅杰斯距離（）和改良的羅杰斯距離（

22、）（，1972； & ，1983）。根據(jù)遺傳特性確定的羅杰斯距離在相關(guān)種質(zhì)的親緣關(guān)系分析中非常有用；而改良的羅杰斯距離還適用于雜種優(yōu)勢(shì)研究。 在種質(zhì)資源研究中，大多數(shù)采用羅杰斯距離（）和改良的羅杰斯距離聚類分析聚類指標(biāo)： 遺傳相似系數(shù) 遺傳距離聚類方法： （ ） 常用分析軟件：2.02（，1998）聚類分析聚類指標(biāo)：分析單標(biāo)記作圖法；區(qū)間作圖法； 復(fù)合區(qū)間作圖法；、分析單標(biāo)記作圖法；A A B B H A BC D - A A F2 20 5 1*1 *2 *3 3 12!*4 *5 *1 6.3 7.7 8.0 6.2 4.1 8.8 6.5 5.4 7.3 8.7 9.0 - 6.8 7.

23、2 7.1 7.6 8.3 8.1 7.5 6.8 F2 ( )（ ）、微陣列（）蛋白質(zhì)組學(xué)新型分子標(biāo)記 ( )新型分子標(biāo)記 是長(zhǎng)約150-400的基因表達(dá)序列片段，攜帶著完整基因的某些片段。 反轉(zhuǎn)錄成，克隆到質(zhì)粒或噬菌體載體，構(gòu)建文庫(kù)，而后大規(guī)模隨機(jī)挑選克隆，對(duì)5或3端進(jìn)行一步法測(cè)序，獲得對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳變異、衰老死亡等過程認(rèn)識(shí)的技術(shù)。 ( ) 是長(zhǎng)約150-400的基因表達(dá)序列片段，攜帶著完整基因的某 (), (), , , , , , , , , , , , , , , , , . . 常用基因組網(wǎng)址：擬南芥: () 水稻： 大豆： 玉米：, 小麥： 棉花: 苜菽： 大麥： 油菜： 高梁

24、： 常用基因組網(wǎng)址：擬南芥: () 單核苷酸多態(tài)（ ）是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，即基因中的點(diǎn)突變。特點(diǎn)：雙等位基因在基因組中的發(fā)生頻率比較高有些位點(diǎn)還影響基因的功能可大大豐富既有的連鎖圖成熟自動(dòng)化技術(shù)，有望分析成千上萬(wàn)的單核苷酸多態(tài)（ ）是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列、從中開發(fā)、目前某些植物全序列的測(cè)定及數(shù)據(jù)庫(kù)的開發(fā)，為、的開發(fā)開辟了新的途徑。優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)序列，與特定功能有聯(lián)系多態(tài)性豐富，可大大豐富標(biāo)記數(shù)目開發(fā)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、 利用芯片技術(shù)，將大量探針固定于玻/硅片上，然后用熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行大量分子雜交，以比較不同組織或器官的基因表達(dá)水平，篩選突變基因，分析基因表達(dá)模式。 優(yōu)點(diǎn)

25、：密度高、制作方便，解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、低通量等不足微陣列（） 利用芯片技術(shù)，將大量探針固定于玻/硅片上，然后用熒光標(biāo)記微型化高通量提高信息量平行化提高信息的可比性微量化降低待檢樣品用量自動(dòng)化提高工作效率低成本可迅速普及推廣生物芯片的特征與優(yōu)點(diǎn)微型化高通量提高信息量平行化提高信息的可比性微量化降低蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,是基因功能的執(zhí)行體，決定了生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等各種性狀。蛋白質(zhì)組研究了解生物體蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)空分布規(guī)律, 不同個(gè)體/組織間的表達(dá)差異蛋白質(zhì)分子標(biāo)記定位生物的表性變異(如抗病、抗逆等性狀)和相關(guān)基因蛋白質(zhì)組學(xué)

26、為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,是基因功能 1 2 3 1 分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳研究中的應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳研究中的應(yīng)用利用遺傳圖和遺傳標(biāo)記可用來加速植物育種進(jìn)程。經(jīng)典遺傳圖譜：形態(tài)、生理和生化標(biāo)記，數(shù)量極為有限，圖譜分辨率大都很低，表現(xiàn)標(biāo)記少，圖距大，飽和度低。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使圖譜上標(biāo)記的密度越來越高。植物基因組遺傳作圖利用遺傳圖和遺傳標(biāo)記可用來加速植物育種進(jìn)程。植物基因組遺傳作構(gòu)建遺傳圖譜 （ ）以具有遺傳多型性的分子標(biāo)記為“路標(biāo)” “ ”以減數(shù)分裂中發(fā)生的遺傳重組交換值為圖距 (%) “ ()”繪制高密度的分子標(biāo)記連鎖圖 構(gòu)建遺傳圖譜 以具有遺傳多型性的分子標(biāo)記為“

27、路標(biāo)”作圖所需的數(shù)據(jù)遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)數(shù)量性狀數(shù)據(jù)作圖所需的數(shù)據(jù)遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)數(shù)量性狀數(shù)據(jù)分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建 定位群體親本間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選 定位群體的組建 定位群體分子標(biāo)記分析 分子標(biāo)記連鎖圖譜的繪制分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建 定位群體親本間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選利用3個(gè)分離群體，一個(gè)人，三個(gè)月時(shí)間，能完成包括1032個(gè)標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜（ 等1995） 。不僅能縮小抗病基因與連鎖標(biāo)記之間的距離，而且在遺傳圖上，可增加染色體末端標(biāo)記和填充空隙，不干擾標(biāo)記簇，從而大大增加了遺傳圖的飽和度。利用3個(gè)分離群體，一個(gè)人，三個(gè)月時(shí)間，能完成包括1032個(gè)標(biāo)在植物遺傳多樣性研究上的應(yīng)用對(duì)植物種質(zhì)資源遺傳多樣性

28、的全面了解，對(duì)于拓寬遺傳基礎(chǔ)的育種策略十分重要。.賈繼增等（1997）利用21條染色體上473個(gè)探針對(duì)小麥遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，小麥不同位點(diǎn)、不同染色體上的遺傳多樣性各不相同，普通小麥B基因組遺傳多樣性較高，其中尤以2B、6B、7B更高，而D組的遺傳多樣性最差。對(duì)在小麥育種中引進(jìn)新的遺傳變異具有一定的意義。在植物遺傳多樣性研究上的應(yīng)用對(duì)植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的全面了 . 通過288個(gè)位點(diǎn)上對(duì)338個(gè)一粒小麥系群指紋分析，結(jié)合種系分析，發(fā)現(xiàn)來源于土耳其東南部山脈的一個(gè)野生一粒小麥（T. ）群體與栽培一粒小麥（T. ）遺傳上最為相近，從而推斷該地區(qū)為現(xiàn)代栽培一粒小麥的發(fā)源地（ 等1998） 。植物起

29、源、分類和進(jìn)化研究 . 通過288個(gè)位點(diǎn)上對(duì)338個(gè)一粒小麥系群指紋分析，結(jié)合品種的指紋圖譜 定義：能夠鑒定作物品種之間差異的電泳圖譜。特點(diǎn)：高度的個(gè)體特異性、環(huán)境的穩(wěn)定性及豐富的多態(tài)性。用途：鑒定品種真實(shí)性和純度，用于新品種登記和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等。其中被推薦為指紋圖譜繪制的最佳方法之一。. 等（1998）利用6個(gè)引物組合產(chǎn)生90多條多態(tài)性條帶，建立了英國(guó)1934-1994廣泛種植的55份小麥的指紋圖譜。 品種的指紋圖譜 定義：能夠鑒定作物品種之間差異的電泳圖譜。特基因定位質(zhì)量性狀的基因定位 近等基因系（ , ）幾乎僅在目標(biāo)性狀上存有差異，一般凡是能在近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記，就極可

30、能位于目標(biāo)基因的兩翼附近。利用方法已定位了許多質(zhì)量性狀基因，.番茄抗病毒基因2a，番茄抗細(xì)菌病毒基因及水稻半矮桿基因等?；蚨ㄎ毁|(zhì)量性狀的基因定位 近等基因系（ , ）原理：將分離群體(F2、）中的個(gè)體依據(jù)目標(biāo)性狀(如抗病、感病)分成兩組，在每一組中將若干個(gè)體等量混合，形成兩個(gè)混合池(如抗病池和感病池)。由于分組時(shí)僅對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，因此兩個(gè)池之間理論上就應(yīng)主要在目標(biāo)基因區(qū)段存有差異，也稱近等基因池法。優(yōu)點(diǎn)：克服了許多作物沒有或難以創(chuàng)造相應(yīng)的限制(等1991)。定位基因：萵苣抗霜霉病基因、水稻抗癭蠓基因水稻抗稻瘟病基因、水稻耐黃叢卷葉病毒病基因等分離群體分組分析法( )原理：將分離群體(F2

31、、）中的個(gè)體依據(jù)目標(biāo)性狀(如抗病、感產(chǎn)量、品質(zhì)、熟期等大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀，均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，受許多數(shù)量基因座位（ , ）和環(huán)境因子的共同作用。數(shù)量遺傳學(xué)無法確定控制數(shù)量性狀的數(shù)目，也無法確定單個(gè)的遺傳效應(yīng)及染色體位置。分子連鎖圖譜的發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)遺傳效應(yīng)的追蹤，從而應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇。目前已發(fā)展了定位的多種方法。數(shù)量性狀基因的定位產(chǎn)量、品質(zhì)、熟期等大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀，均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特基于圖譜的基因克隆 誰(shuí)最先了解基因的功能，誰(shuí)就擁有了該基因的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，也就獲得了更多的利潤(rùn)?？寺』蛲緩秸蜻z傳學(xué)和反向遺傳學(xué)。前者以欲克隆基因的功能為基礎(chǔ)，通過鑒定其產(chǎn)物或某種表型的突變進(jìn)

32、行；后者則著眼于基因本身，通過其特定的序列或其在基因組中的特定位置進(jìn)行?；趫D譜的基因克隆 誰(shuí)最先了解基因的功能，誰(shuí)就擁有了該基因的圖位克隆條件：(1)目標(biāo)基因附近緊密連鎖的標(biāo)記；(2)知道這些標(biāo)記與目的基因的位置一旦建立與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記圖，就可以找到染色體步行的起始點(diǎn)，從而進(jìn)行定位克隆。圖位克隆條件：比較基因組研究 利用相同的分子標(biāo)記（主要是標(biāo)記和基因克?。┰谙嚓P(guān)物種之間進(jìn)行遺傳或物理作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布特點(diǎn)，揭示染色體或染色體片段上的基因及其排列順序的相同或相似性，并由此對(duì)相關(guān)物種的基因組結(jié)構(gòu)和起源進(jìn)化進(jìn)行分析。比較基因組研究 利用相同的分子標(biāo)記（主要是標(biāo)

33、記和基因克?。┰谛掳l(fā)現(xiàn)：不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性、拷貝數(shù)及連鎖順序上都具有很大程度的保守性。 番茄、馬鈴薯和辣椒（等1988；1992）；水稻、小麥和玉米（等，1993；1994）；小麥、大麥和黑麥（等，1993）；高粱和玉米（等，1994）；以及大麥和水稻（等，1996）新發(fā)現(xiàn)：不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性、拷貝數(shù)及連鎖順序上都分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用課件比較基因組學(xué)研究表明，不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性，拷貝數(shù)及連鎖順序上都具有很大程度的保守性。啟示：模式植物上遺傳作圖成果可推而廣之?？山柚容^基因組共享分子標(biāo)記，使建立高密度遺傳連鎖圖可資利用的標(biāo)記顯著增加，從而大大提

34、高了獲取離目標(biāo)基因很近分子標(biāo)記的的可能性。比較基因組學(xué)研究表明，不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性，拷貝數(shù)應(yīng)用比較基因組學(xué)進(jìn)行基因的克隆綠色革命1、2基因的克隆擬南芥 水稻 篩選小麥文庫(kù) 1、2探針標(biāo)記應(yīng)用比較基因組學(xué)進(jìn)行基因的克隆綠色革命1、2基因的克隆探針標(biāo)深遠(yuǎn)意義比較基因組研究已使得傳統(tǒng)的植物遺傳學(xué)突破了物種的框架限定，發(fā)展成了新的系統(tǒng)遺傳學(xué)。隨著最近一些生物的基因組全序列的獲得，比較基因組研究也隨之步入了一個(gè)新的時(shí)代。深遠(yuǎn)意義研究基因表達(dá)與調(diào)控傳統(tǒng)方法是利用文庫(kù)篩選和雜交。研究基因表達(dá)是非常有效的方法，可同時(shí)比較植物發(fā)育的不同時(shí)期以及分離某些重要基因（）。研究基因表達(dá)與調(diào)控傳統(tǒng)方法是利用文

35、庫(kù)篩選和雜交。利用的方法，闡明了馬鈴薯塊莖在不同發(fā)育階段基因表達(dá)的情況，并克隆了2個(gè)與塊莖脂肪氧合酶高度同源的片段（等1996） 。利用的方法，闡明了馬鈴薯塊莖在不同發(fā)育階段基因表達(dá)的情況，并在植物育種上的應(yīng)用在雜交育種中，單單根據(jù)育種材料的表型特點(diǎn)選配親本，往往會(huì)受到環(huán)境條件的干擾。輔之以分子標(biāo)記的差異性分析，將使得親本選配更為快速、準(zhǔn)確，從而提高育種效率。揭示育種材料之間的親緣關(guān)系在植物育種上的應(yīng)用在雜交育種中，單單根據(jù)育種材料的表型特點(diǎn)選雜種優(yōu)勢(shì)利用正成為許多作物提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的重要途徑。對(duì)遺傳差異與雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系的評(píng)價(jià)方法經(jīng)歷了從形態(tài)性狀遺傳距離，到生化標(biāo)記遺傳差異，親緣系數(shù)，以及分

36、子標(biāo)記遺傳差異等各種嘗試。雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)及機(jī)理研究雜種優(yōu)勢(shì)利用正成為許多作物提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的重要途徑。雜種 分子標(biāo)記的應(yīng)用，使得能夠在整個(gè)基因組范圍內(nèi)對(duì)大量親本材料間的遺傳距離進(jìn)行估測(cè)，并在此基礎(chǔ)上有效地預(yù)測(cè)具有強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的組合（等，1992；，1994）。結(jié)果：既有相關(guān)性很高的報(bào)道，又有完全相反的結(jié)果。分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用課件張啟發(fā)認(rèn)為：分子標(biāo)記雜合度與雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性因遺傳材料而異，在經(jīng)過改良的優(yōu)良種質(zhì)中，兩者之間高度相關(guān)，而在一些未經(jīng)改良的優(yōu)良種質(zhì)中，相關(guān)程度很低。提出了“上位性是雜種優(yōu)勢(shì)的主要遺傳基礎(chǔ)”的重要觀點(diǎn)。張啟發(fā)認(rèn)為：應(yīng)用技術(shù)進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的研究表明，強(qiáng)優(yōu)勢(shì)與弱優(yōu)

37、勢(shì)組合間基因表達(dá)有明顯差異，有增強(qiáng)型、減弱型和沉默型。雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)與單親沉默、雙單親沉默有密切關(guān)系。應(yīng)用技術(shù)進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的研究表明，強(qiáng)優(yōu)勢(shì)與弱優(yōu)勢(shì)組合間基大量研究表明，雖然分子標(biāo)記揭示的遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系比較復(fù)雜，但親本之間的遺傳差異是產(chǎn)生的主要原因。通過對(duì)與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)效應(yīng)的研究，可以加深對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的了解。大量研究表明，雖然分子標(biāo)記揭示的遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系比較我國(guó)玉米種質(zhì)基礎(chǔ) 亞群 類群 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種 四平頭黃早四旅大紅骨丹340AB73掖478B17 齊319我國(guó)玉米種質(zhì)基礎(chǔ) 亞群 類群 分子標(biāo)記輔助選擇（ ) 分子標(biāo)記輔助選擇幾乎不受環(huán)境條件的影響，還可以跟蹤外源基因，克服回交的缺點(diǎn)，可大大提高選擇的效率。長(zhǎng)期以來，選擇都是基于植株的表型性狀進(jìn)行的。植物的許多性狀為數(shù)量性狀，受許多微效基因的控制，且易受環(huán)境的影響。分子標(biāo)記輔助選擇（ ) 分子標(biāo)記輔助選擇幾乎不受環(huán)境條件快速有效地選擇出帶有目標(biāo)基因的單株表現(xiàn)在:1.不受環(huán)境條件及生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響，在苗期或低世代就可進(jìn)行篩選;2.利用共顯性標(biāo)記可直接對(duì)隱性目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，無