分子遺傳學(xué)第三章 DNA的功能課件

1、第三章 DNA的功能第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄 Transcription DNA一般存在于核內(nèi)，蛋白質(zhì)合成則在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，那么DNA是怎樣控制蛋白質(zhì)的合成呢？ 一. RNA是中間體：實(shí)驗(yàn)證據(jù)用放射性RNA前體（如尿嘧啶）作標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，最先合成的放射性RNA是在細(xì)胞核中產(chǎn)生的；然后用非放射性RNA前體作跟蹤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果：放射性RNA又流向了細(xì)胞質(zhì)，這提示，在DNA和蛋白質(zhì)之間的遺傳信息傳遞過(guò)程中，RNA是一中間物。 用非放射性用放射性RNA前體標(biāo)記 示蹤后RNA出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)中 RNA前體示蹤遺傳信息的流向中心法則如用T2 噬菌體感染大腸桿菌，最明顯的變化是 RNA 的快速合成，而且發(fā)現(xiàn)RNA與T2噬菌體的DN

2、A的核苷酸成份是非常相近的。證明 RNA是由DNA合成而來(lái)的，然后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)的特定場(chǎng)所指導(dǎo)合成特定的蛋白質(zhì)，因此遺傳信息的流向包括三個(gè)步驟。DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄 核RNARNA 質(zhì)轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄 以DNA為模板，按照堿基互補(bǔ)原則合成一條單鏈RNA，從而將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA中去的過(guò)程稱轉(zhuǎn)錄（transcription），RNA合成以53方向進(jìn)行。 轉(zhuǎn)錄 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在DNA的一條鏈上。分子雜交證明，某一基因的RNA只能與其DNA的一條鏈有雜交反應(yīng)，即說(shuō)明DNA上只有一條鏈可作為模板合成該基因的RNA。 5 3 變性分開(kāi)5 3 + 標(biāo)記的RNA 復(fù)性 5 5 5 3 3

3、 3 3 5 模板鏈（或互補(bǔ)鏈）編碼鏈 三、轉(zhuǎn)錄的起始（Initiation） 1啟動(dòng)子（promoter）：是DNA轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)的一段序列，它能指導(dǎo)全酶與模板正確地結(jié)合，并活化酶使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄形式。 大腸桿菌啟動(dòng)子序列分三個(gè)部位：R位點(diǎn)：RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)；B位點(diǎn)：結(jié)合部位；I位點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始部位。 10區(qū) 35區(qū) pribnow box TGTTGACA1517bpTATAAT58bp起始點(diǎn)）+1 2RNA聚合酶 E.coli RNA聚合酶500kd，由、五種不同的亞基組成，全酶：2。 核心酶：2； 因子本身無(wú)催化功能，當(dāng)它與核心酶結(jié)合時(shí)可使RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子序列，并能特異性地

4、在這些部位上形成穩(wěn)定的復(fù)合體。The early stages of transcription in prokaryotes, showing (a) the components of the process; (b) template binding at the 10 site involving the sigma subunit of RNA polymerase and subsequent initation of RNA synthesis; and (c) chain elongation, after the sigma subunit has dissociated f

5、rom the transcription complex and the enzyme moves along the DNA template.12-8五、轉(zhuǎn)錄的終止（Termination） RNA聚合物也能識(shí)別鏈的終止信號(hào)。 1在某些情況下，識(shí)別作用是直接的。終止子（tenminator）：轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，其作用是在DNA模板特異位置處終止RNA的合成。在終止處RNA聚合酶作用停止，新生RNA鏈釋放， 2識(shí)別終止信號(hào)有時(shí)需要某些蛋白質(zhì)因子（rho因子）的作用，rho因子與RNA聚合酶相互作用導(dǎo)致RNA鏈釋放。終止子（terminator）：DNA序列上轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，其作用是在DNA模

6、板的特定位置處終止RNA的合成。DNA上終止子有兩個(gè)明顯特征：如下圖（1）鏈內(nèi)具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)，能使轉(zhuǎn)錄物形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；（2）DNA上有一串A，轉(zhuǎn)錄形成的RNA 3端具有多個(gè)U，AU配對(duì)不牢固，使RNA脫落。 UCC U G G C A U25 C G 15C G G C C G C G 5UAAUCCCACAG CAUUUU 3 535 核糖體ribosomes 是由核糖體蛋白和核糖體RNA（rRNA）組成的復(fù)合體。在電鏡下，一個(gè)核糖體象一個(gè)墨滴。有關(guān)核糖體的精細(xì)的功能仍然是目前眾多研究中的重要課題，rRNA分子如何與蛋白質(zhì)相結(jié)合以及其功能目前仍然不清楚。A comparison of the

7、 components in the prokaryotic and eukaryotic ribosome 13-1 二、蛋白質(zhì)合成 3新的氨基酸通過(guò)肽鍵接到生長(zhǎng)的鏈上： aa3-tRNA3 + aa1-aa2-tRNA2aa1-aa2-aa3-tRNA3 + tRNA2（釋放） 較大的多肽 4上述過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行直至aan（最后一個(gè)aa連接上) ,整個(gè)過(guò)程還需mRNA，核糖體，一些蛋白質(zhì)因子，酶和無(wú)機(jī)離子。 三、蛋白質(zhì)合成的特異性1. 識(shí)別mRNA上編碼特異性氨基酸的密碼子是tRNA還是氨基酸?半胱氨酸-tRNA半 丙氨酸t(yī)RNA半 用雜合性的丙氨酸t(yī)RNA半合成的蛋白在原先預(yù)期是半胱氨酸 的

8、位置上都是丙氨酸。 結(jié)論：氨基酸在語(yǔ)言上有錯(cuò)誤，識(shí)別密碼子是由tRNA的特異 性決定的。鎳化氫2反密碼子（anticodon）：tRNA上能識(shí)別一個(gè)mRNA密碼子的位置，這個(gè)位置上的堿基與密碼子的堿基是互補(bǔ)的。3tRNA的一般結(jié)構(gòu)和功能區(qū)由于tRNA上反密碼子環(huán)能識(shí)別mRNA相應(yīng)的密碼子，因此在遺傳信息的轉(zhuǎn)譯中起十分重要的作用。4tRNA來(lái)自何處？一個(gè)基因一條多肽的理論并不是完全正確的，有些基因編碼蛋白，而另一些基因（如rRNA或tRNA基因）是編碼并合成RNA作為終產(chǎn)物。 Holleys two-domensional cloverleaf model of transfer RNA. 13

9、-3A three-dimensional model of transfer RNA. 13-4四、核糖體功能和蛋白質(zhì)合成 1. 轉(zhuǎn)譯組分Elongation of the growing polypeptide chain during translation. 3.延長(zhǎng)Termination of the process of translation. 13-84.終止在原核生物中，轉(zhuǎn)譯并不等到mRNA合成完成之后開(kāi)始，一部分mRNA合成后，核糖體能立即附著到mRNA上起動(dòng)轉(zhuǎn)譯，而在真核生物中，轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯有時(shí)間和空間上的分開(kāi)。 第三節(jié) 遺傳密碼 The Genetic Code 假如核苷

10、酸對(duì)是密碼中的字母，字母的不同組合會(huì)形成代表不同氨基酸的文字，要解決的問(wèn)題是：1.密碼是重疊還是非重疊的?2.由多少個(gè)字母組成一個(gè)文字?即密碼子3.哪一種特定的密碼子或哪幾種密碼子代表各自特 定的氨基酸? 一、遺傳密碼的非重疊性 ( nonoverlapping) 11961年，用遺傳分析證明，遺傳密碼是非重疊的實(shí)驗(yàn)證據(jù)：對(duì)TMV由亞硝酸誘發(fā)的突變的蛋白作分析表明，在某一蛋白質(zhì)區(qū)段中一次只有一個(gè)氨基酸的變化。如果是重疊密碼子，那么一個(gè)堿基的變化將會(huì)使蛋白質(zhì)中鄰近位置上多達(dá)三個(gè)氨基酸的變化。 A T T G C T C A G C T T G A C A T T T T G T G C G C

11、T C T COverlapping code aa1 aa2 aa3 aa4 aa5 1 2 3 4 5 Nucleic acidNonoverlapping code aa1 aa2 aa3 aa4 aa5Amino acidCodonCodonAmino acid 非重疊密碼子和重疊密碼子的區(qū)別 2在某一特定蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯中是以非重疊方式讀碼的，但并不排除用相應(yīng)不同的讀碼框架（reading frames）來(lái)編碼不同蛋白質(zhì)的氨基酸的可能性。一種蛋白編碼方式 ATT GCT CAG CTT G 另一種蛋白解讀時(shí)移動(dòng)一個(gè)堿基： A TTG CTC AGC TTG二、密碼中字母的數(shù)目 理論上推測(cè)

12、：至少三個(gè)核苷酸對(duì)組成一個(gè)密碼子：43 = 64種 三、利用抑制基因證明密碼三聯(lián)體性質(zhì) 60年代初，Crick等用遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了密碼子的三聯(lián)體特征： 1原黃素能誘發(fā)T4的rII突變（不能在K上生長(zhǎng)），其作用是在DNA鏈中造成單個(gè)核苷酸對(duì)的插入或缺失： 插AT A TC T A G T C T T A GA T C A G A A T C T G T C T T A G A C A G A T A G A C A A 缺CG A T C T G T T 開(kāi)始由原黃素誘導(dǎo)的突變體稱FCO突變體，F(xiàn)CO再經(jīng)黃原素處理會(huì)自發(fā)產(chǎn)生能在E.coli K（）上形成野生型噬菌斑的“回復(fù)突變體”（revert

13、ants）。對(duì)這些突變體作遺傳分析發(fā)現(xiàn)，與真正的野生型不同，其回復(fù)突變的表型是由于在FCO的同一順?lè)醋又胁煌稽c(diǎn)上發(fā)生了第二個(gè)突變。這種第二個(gè)突變抑制了原先FCO突變的表達(dá) 突變抑制基因（Suppressor mutation）：能反作用于或抑制另一突變的效應(yīng)。（1）抑制基因與它被抑制的那個(gè)基因的位置不同；（2）可位于同一基因內(nèi)，也可位于不同的基因內(nèi)；（3）不同的抑制基因有不同的功能。 利用重組可以從原初的正向突變體分離到抑制基因突變體。奇怪的是，發(fā)現(xiàn)該抑制基因自身也是一種rII突變。 rII(FCO)rIIrII回復(fù)rIIrII+ +rIIrII和分離FCO和抑制基因Wild type 怎樣

14、解釋上述結(jié)果？ 原黃素誘導(dǎo)的單個(gè)核苷酸對(duì)的插入或缺失會(huì)引起移碼突變（frame-shiit mutation），從而引起大多數(shù)密碼的錯(cuò)讀，但是在某個(gè)地方由于插入和缺失的補(bǔ)償作用，會(huì)恢復(fù)合適的讀碼，只在兩個(gè)突變位點(diǎn)之間產(chǎn)生一小段錯(cuò)誤的密碼： （用三字母英文單詞代表密碼子） THE FAT CAT ATE THE BIG RAT 缺C：THE FAT ATA TET HEB IGR AT 插A：THE FAT ATA ATE THE BIG RAT插入恢復(fù)了信息中大多數(shù)密碼的含義，從而抑制了缺失的效應(yīng)大多數(shù)密碼的錯(cuò)讀大部分恢復(fù)合適的讀碼 假定FCO突變是由于一個(gè)核苷酸對(duì)的插入，那么第二個(gè)突變即抑制

15、基因突變就應(yīng)該是一個(gè)缺失，因?yàn)橹挥羞@樣才能恢復(fù)該基因的讀碼框。假定密碼由三字母組成： 野生型：CAT CAT CAT CAT CAT rII 插入A：CAT ACA TCA TCA TCA T 不正確 rIIrII 缺失A： CAT ACA TCT CAT CAT 正確結(jié)論 在抑制性基因型中只有少數(shù)密碼子錯(cuò)誤，大部分可恢復(fù)原來(lái)野生型的密碼子，從而產(chǎn)生近乎正常的酶。因此具有類似野生型表型。這與Crick發(fā)現(xiàn)的抑制基因突變體表型回恢的遺傳事實(shí)相符。2符號(hào)突變 如果將FCO突變的插入定為“+”，那么抑制基因突變就可自動(dòng)地定為“”，一個(gè)突變與它的抑制因子的符號(hào)相反，實(shí)驗(yàn)證明：一個(gè)“+”不能抑制一個(gè)“+

16、”，一個(gè)“”也不能抑制一個(gè)“”，相同符號(hào)的兩個(gè)突變永遠(yuǎn)不會(huì)相互抑制。 Crick用巧妙的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了三聯(lián)體密碼學(xué)說(shuō)的第一個(gè)證據(jù)：*構(gòu)成“+”或“”的三重突變組合共同作用可以恢復(fù)到野生型表型，這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明：遺傳密碼的單詞是由三個(gè)連續(xù)的核苷酸對(duì)組成的?；謴?fù)合適的讀碼進(jìn)一步圖解 ： CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT ACA TAT CAT CAT CAT 正常 * 結(jié)論：只有密碼子是三聯(lián)體才會(huì)使一個(gè)基因內(nèi)的三個(gè)插入或三個(gè)缺失自動(dòng)恢復(fù)正確讀碼,才可以恢復(fù)到野生型表型. Deletions 四、遺傳密碼的兼并性（degeneracy）一個(gè)氨基酸具有兩個(gè)或多個(gè)不同的密碼子

17、稱作密碼的兼并性。如果只有20種三聯(lián)密碼有意義，其余44種為無(wú)意義，那么大多數(shù)移碼突變將導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的終止。小結(jié)有關(guān)密碼的基本知識(shí)：（1）密碼是非重疊的。（2）密碼子是三聯(lián)體。（3）讀碼從一固定的起始點(diǎn)開(kāi)始一直連續(xù)不斷地讀至編碼序列的末端，移碼突變會(huì)改變序列中其余密碼子的排列。（4）密碼子是兼并的，一個(gè)氨基酸不只有一種密碼子。第四節(jié) 遺傳密碼的破譯Cracking the code遺傳密碼的破譯確定每種三聯(lián)體的含義，這是過(guò)去近四十年來(lái)遺傳學(xué)中最重大的突破之一。一、破譯密碼的試驗(yàn)1制備單一核苷酸的mRNA。Nurenberg（1961）用大腸桿菌蛋白 質(zhì)合成的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)。 Poly U：苯丙氨

18、酸的多肽（UUU）。 CCC：脯，GGG：甘，AAA：賴。2合成含有兩種和三種不同核苷酸的mRNA，確定了許多氨基酸的密碼子組成，但尚不能確定順序。如將U和G以3：1摻入合成的mRNA，可得以下結(jié)果： 由3/4U和1/4G合成的mRNA中各種密碼子的預(yù)期頻率密碼子機(jī)率比例 UUU p(UUU)=(3/4)(3/4)(3/4)=27/64 1.00 UUG p(UUG)=(3/4)(3/4)(1/4)=9/64 0.33 UGU p(UGU)=(3/4)(1/4)(3/4)=9/64 0.33 GUU p(GUU)=(1/4)(3/4)(3/4)=9/64 0.33 UGG p(UGG)=(3/

19、4)(1/4)(1/4)=3/64 0.11 GGU p(GGU)=(1/4)(1/4)(3/4)=3/64 0.11 GUG p(GUG)=(1/4)(3/4)(1/4)=3/64 0.11 GGG p(GGG)=(1/4)91/4)(1/4)=1/64 0.03由3/4U和1/4G組成的mRNA轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)中各種氨基酸的比例氨基酸比例密碼子組成苯1.00亮0.37UUUG+2U纈 0.36G+2U半胱 0.35G+2U色0.14U+2G甘0.12U+2G 3三聯(lián)體結(jié)合試驗(yàn) 最終破譯密碼的試驗(yàn)是三聯(lián)體結(jié)合試驗(yàn)。1964年Nurenberg設(shè)計(jì)。原理：特定Mini mRNA（三聯(lián)體）能與特定的t

20、RNA氨基酸和核糖體組成復(fù)合體，這種復(fù)合體不能通過(guò)硝酸纖維濾膜，而未與Mini mRNA結(jié)合的tRNA氨基酸能通過(guò)濾膜，從而達(dá)到檢定。 例子與步驟：1. 制備Mini mRNA GUU，加到有E.coli核糖體，各種tRNA及20種氨基酸的合成體系中反應(yīng)，每次反應(yīng)中只有一種氨基酸（隨意的）是用14C標(biāo)記的，反應(yīng)系統(tǒng)經(jīng)濾膜過(guò)濾后，其中只有與核糖體結(jié)合的GUU和14C標(biāo)記的相應(yīng)于該密碼子的氨酰tRNA復(fù)合體結(jié)合到膜上，其它未與GUU結(jié)合的tRNAaa都流走，直至找到GUU結(jié)合的標(biāo)記氨基酸為止。 很快解決了G+2U三種異構(gòu)三聯(lián)體的意義：如：GUU將纈氨酰tRNA纈結(jié)合到核糖體上，因此，GUU為纈氨酸

21、密碼子。同樣可測(cè)定UUG為亮氨酸密碼子，UGU為半胱氨酸密碼子。4用三聯(lián)體多聚體作模板體外合成多肽。如用（UUC）。多核苷酸作模板可按三種方式中的任何一種方式讀碼：（1）UUC UUC UUC UUC （2）UCU UCU UCU UCU （3）CUU CUU CUU CUU 在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中會(huì)得到三種肽鏈，一條是單一苯丙氨酸肽鏈,一條是單一絲氨酸肽鏈，再一條是單一亮氨酸肽鏈，從而縮小了（C+2U）密碼子意義的范圍。再經(jīng)三聯(lián)體結(jié)合試驗(yàn)可以很快確定UUC為苯丙氨酸密碼子，UCU為絲氨酸密碼子，CUU為亮氨酸密碼子。二、某些氨基酸會(huì)有多個(gè)密碼子原因主要有二個(gè)：1有些氨基酸能被多個(gè)不同的tRNA帶到核

22、糖體上，不同的tRNA有不同的反密碼子。2某些tRNA能將特異的aa帶到多種密碼子上，因?yàn)閴A基的配對(duì)在密碼子的3端和反密碼子的5端是不嚴(yán)格的，這種松散的配對(duì)學(xué)說(shuō)稱擺動(dòng)學(xué)說(shuō)，反密碼子5位的G能與C和U配對(duì)，說(shuō)明一種tRNA（圖中攜帶絲氨酸）能識(shí)別UCU和UCC兩種密碼子。 AG G UCU/C 53mRNA 密碼子3 5 反密碼子環(huán) 密碼子反密碼子配對(duì)擺動(dòng)原則 反密碼子5端 密碼子3 G U orCC G onlyA U onlyU A or GI U,C or A 密碼子反密碼子配對(duì)原則三、終止密碼子（Stop Codons)定義：并不編碼任何aa，為肽鏈合成終止的信號(hào)。1965年，Brenn

23、er等發(fā)現(xiàn)終止密碼子。將T4噬菌體控制頭部蛋白合成的一個(gè)順?lè)醋又械?種突變體蛋白的末端與野生型比較，記下每個(gè)突變體蛋白末端接下來(lái)的那個(gè)氨基酸，這6種aa在其密碼子的一個(gè)核苷酸位置發(fā)生變化就會(huì)形成UAG，因此UAG是一個(gè)終止密碼子。野生型 m+Su+ m1Su+（谷酰）CAG m2Su+（賴) AAG m3Su+(谷) GAG m4Su+(酪) UAU UAG m5Su+(色) UGG m6Su+(絲) UCG mSu 多肽長(zhǎng)度緊跟突變體蛋白末端接下來(lái)的那個(gè)氨基酸：UAG終止密碼子稱為琥珀型密碼子（amber codon），由琥珀密碼子造成的突變稱為琥珀型突變（amber mutation），另

24、二個(gè)終止密碼子為UGA（乳白型Ocher）。UAA（赭石型ocher）* 終止密碼子也稱無(wú)義密碼子（nonsense codons），無(wú)義突變是指某一密碼子變?yōu)榻K止密碼子后造成肽鏈合成中斷的突變，而錯(cuò)義突變（missense mutation）是導(dǎo)致多肽鏈中單個(gè)氨基酸的變化，是一種aa的密碼子變?yōu)榱硪籥a的密碼子的突變。四、無(wú)義突變抑制基因 * Nonsense Suppressor Mutations是tRNA反密碼子環(huán)上發(fā)生突變的tRNA基因，它能識(shí)別mRNA上的一個(gè)無(wú)義密碼子，因此它能將攜帶的氨基酸在無(wú)義密碼子處插入，從而使轉(zhuǎn)譯能順利通過(guò)那個(gè)無(wú)義密碼子，而不致造成肽鏈合成的中止。 酪氨酸

25、反密碼子發(fā)生突變后能識(shí)別終止密碼子UAG，UAG的終止作用受到了突變的tRNA抑制后，肽鏈得以繼續(xù)延伸。五、起始密碼子Start CodonAUG為起始密碼子，在mRNA中，通常編碼Met，而在大多數(shù)原核生物中新的多肽的第一個(gè)氨基酸一般為NfMet。攜帶NfMet的tRNA能起始一條多肽但不能插入到一條生長(zhǎng)的鏈中；攜帶Met的tRNA能插入到生長(zhǎng)的肽鏈中，但不能起始一條肽鏈；這二種tRNA具有相同的反密碼子，并與密碼子AUG互補(bǔ)。小結(jié)：遺傳信息的貯存、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯在所有的生物中基本上是一致的。 至1966年，全部64種遺傳密碼破譯 第五節(jié) 真核生物RNA在真核生物中，RNA的合成和加工在某

26、些方面不同于原核生物 一、RNA合成 在原核生物中，只用單一的RNA聚合酶合成各種類型的RNA；而在真核系統(tǒng)中，有三種不同的RNA聚合酶：（1）RNA聚合酶1合成tRNA；（2）RNA聚合酶II合成mRNA，mRNA是單順子反子（monocistron），而在原核生物中許多mRNA是多順?lè)醋印＃╬olycistron） ；（3）RNA聚合酶III合成tRNA。二、RNA的加工由細(xì)胞核產(chǎn)生的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物在運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)作轉(zhuǎn)譯之前通常要以多種方式進(jìn)行加工：1在轉(zhuǎn)錄物的5端通過(guò)三磷酸鍵結(jié)合上一個(gè)7甲基鳥 苷，即“戴帽”。 2在3端加一串多聚腺苷，即由polyA組成的尾巴 （150200）。 3剪接，除去RNA轉(zhuǎn)錄物的某些內(nèi)部的插入序列 （intervening seguences）。由細(xì)胞核產(chǎn)生的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物在運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)作轉(zhuǎn)譯之前通常要以多種方式進(jìn)行加工 12-9三、斷裂基因 (Split Genes) 1DNA分子上編碼蛋白區(qū)被一些間隔序列分開(kāi)，這些間隔序列稱為內(nèi)含子（intron）。Those DNA sequences tha