ABA對(duì)擬南芥AtHsfA1a在冷脅迫響應(yīng)中生理指標(biāo)的影響

1、ABA對(duì)擬南芥AtHsfAla在冷脅迫響應(yīng)中生理指標(biāo)的影響摘要：為從生理水平探討低溫下脫落酸(ABA)與擬南芥熱激因子AtHsfAla的關(guān)系，以擬南芥熱激因子 AtHsfAla基因T-DNA插入突變型(MT)和野生型(WT)擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，研究外源ABA對(duì)AtHsfAla 不同基因型擬南芥在低溫下的生理指標(biāo)的影響.結(jié)果表明，低溫可使幼苗中MDA和H2O2增加， AtHsfAla基因突變型增加較明顯，加入外源ABA后MDA和H2O2有所降低，AtHsfAla基因突變型降低較 少.而抗氧化酶變化趨勢(shì)正好相反，突變型擬南芥的SOD、CAT、GR和APX活性在低溫中比野生型升高 小，ABA對(duì)冷脅迫中

2、突變型擬南芥抗氧化酶SOD、CAT、GR和APX活性影響較小.說明外源ABA在 AtHsfAla提高抗冷性過程中有調(diào)控作用.關(guān)鍵詞：脫落酸；擬南芥熱激因子AtHsfAla;冷脅迫；生理指標(biāo)Effects of ABA on Physiological Indexes of Arabidopsir AtHsfAla in Response to Cold StressAbstract: In order to study the relationship between abscisic acid ( ABA) and Arabidopsis heat shock factor AtHsfAla

3、 at low temperature，Arabidopsis heat shock factor AtHsfAla gene Mutant of T-DNA insertion ( MT) and wild type ( WT) of Arabidopsis were used as experimental materials to study the effect of Exogenous ABA on the physiological indexes of different AtHsfAla genotypes of Arabidopsis seedlings at low tem

4、perature. The results showed that the content of MDA and H202 in the Arabidopsismutant increased significantly. The content of MDA and H2O2 decreased after the addition of Exogenous ABA, while that of MDA and H2O2 decreased less in AtHsfAla gene mutation， but the change trend of antioxidant enzymes

5、was the opposite. The SOD， CAT， GR and APX of Arabidopsis mutant increased less; ABA had little effect on the activity of SOD，CAT，GR and APX of Arabidopsis mutant under cold stress. It is suggested that exogenous ABA can regulate on the process of improving the cold resistance of AtHsfAla.Key words：

6、 ABA; Arabidopsis heat shock factor AtHsfAla; cold stress; physiological index近年來，植物激素脫落酸(Abscisic acid, ABA)作為環(huán)境脅迫中的重要信號(hào)分子，其研究 范圍越來越深入廣泛.研究I1#3表明，植物在高 溫、低溫、干旱、鹽脅迫等逆境中體內(nèi)ABA迅速 積累而增強(qiáng)抗逆性.熱激因子(Heat shock transcription factor, HSF)是真核生物中相對(duì)保守的一 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族囪.作為逆境信號(hào)傳導(dǎo)通路中的 重要成員，它能直接啟動(dòng)下游抗逆境基因的表達(dá)， 從而提高抗逆境的能力：7-10.

7、有資料顯示：擬南 芥熱激因子HsfA6b作為ABA信號(hào)通路下游的一個(gè) 正調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)，是耐熱性建 立所必需的皿；小麥熱激因子TaHsfC2a通過ABA 介導(dǎo)的調(diào)控途徑構(gòu)建了耐熱機(jī)制詢；并且外源 ABA能通過H2O2上調(diào)水稻葉片中熱激因子OsHs- fA4a和OsHsfAVa的表達(dá)盡管研究顯示，在逆 境中ABA能調(diào)控部分熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF的表達(dá)， 但關(guān)于ABA與轉(zhuǎn)錄因子HSF如何從生理水平協(xié)同 提高抗逆性的研究相對(duì)較少.眾所周知，在自然界 中植物往往通過自身的生理防御系統(tǒng)保護(hù)自己免受 逆境的傷害.已知植物在逆境中會(huì)產(chǎn)生大量的活性 氧(AOS)，活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的氧化損 傷

8、14-16.而植物細(xì)胞存在抗氧化酶系統(tǒng)，包括 SOD( EC,1. 15. 11)，CAT( EC, 1. 11. 1.6)，GR( EC, 1.6. 4. 2)和 APX( EC,1. 11. 1.7),在逆境中它們的 活性可得到不同程度的增強(qiáng)，能將活性氧控制在細(xì) 胞可以忍耐的水平17-23.大量研究2-5發(fā)現(xiàn)，外 源ABA在逆境中會(huì)提高抗氧化酶的活性而降低氧 化脅迫的傷害.本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，過量表 達(dá)擬南芥熱激因子AtHsfA1a植株中的抗氧化酶 SOD、CAT和APX活性會(huì)明顯增強(qiáng)切而降低滲透 脅迫.哪ABA與擬南芥熱激因子AtHsfA1a是否會(huì) 影響逆境生理指標(biāo)存在協(xié)調(diào)效應(yīng)，值得

9、進(jìn)一步 研究.為了研究外源ABA對(duì)擬南芥熱激因子AtHsfAla 在低溫響應(yīng)中生理指標(biāo)的影響，采用AtHsfAla基因 T-DNA插入的突變體及野生型的擬南芥幼苗為材 料，在冷脅迫下分析AtHsfA1a突變體及野生型植 株的逆境生理生化指標(biāo)MDA、H2O2、SOD# CAT# GR和APX變化，以及擬南芥熱激因子AtHsfA1a 在響應(yīng)熱脅迫中ABA的生理調(diào)控作用，以期為進(jìn) 一步研究植物耐逆境機(jī)理奠定生理基礎(chǔ).1材料與方法1材料采用擬南芥哥侖比亞種(Arabidopsis thaliana, Ecotype Columbia)的 T-DNA 插入AtHsfAla基因突 變型(SALK-0680

10、42,簡(jiǎn)稱MT)為實(shí)驗(yàn)材料，以 野生型(簡(jiǎn)稱WT)為實(shí)驗(yàn)對(duì)照.實(shí)驗(yàn)材料購(gòu)于美 國(guó)生物資源中心ABRC.方法1.2.1材料栽培及低溫處理兩種基因型(MT和WT)種子依次用0.1% 的HgCl2和體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進(jìn)行滅菌處理, 在無菌條件下播種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，置于 光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：溫度22S、光照 12 000 lx16h/d.取4周的擬南芥幼苗浸沒在SIB Buffer( 0. 5 mmol / L K2HPO4,0. 5 mmol/L KH2PO4 , 1%蔗糖,pH6.0)中，低溫4S處理2d.以22 S 為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的處理溫度.MDA 測(cè)定取低溫處理過的小苗500

11、mg在液氮中研碎, 懸浮于5 mL 10%的三氯乙酸中.采用TBA法對(duì)植 物葉片的MDA進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定450, 532, 600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)C =6. 45 ( A532 - A600)- 0. 56A450計(jì)算 MDA 濃度18.H2O2 測(cè)定取低溫處理過的小苗500 mg在液氮中研碎, 懸浮于1.5mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液中 (pH6. 8) . H2O2 濃度分析按照 Gay and Gebicki 2000年的方法詢.抗氧化酶活性測(cè)定酶的提取.取低溫處理過的小苗500 mg, 加入 5 mL 50 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH7. 0),

12、內(nèi)含 20% 甘油，1 mmol / L ASA, 1 mmol / L DTT, 1 mmol/L EDTA , 1 mmol/L GSH 及 5 mmol/L MgCl2,在冰上研磨后，提取液在4 S下，經(jīng)過 20 000 X g離心30 min,上清液用來測(cè)定酶活性.酶活性測(cè)定.SOD活性的測(cè)定方法參照 Zhang等邸的方法，以加入鄰苯三酚來啟動(dòng)反應(yīng)， 同時(shí)每30 s記錄1次319. 5 nm處的吸光值，共測(cè) 4 min; CAT活性的測(cè)定方法參照Aebi21的方法， 在240 nm下測(cè)定；APX活性的測(cè)定方法參照Rao 等22的方法，在290 nm下測(cè)定；GR的測(cè)定參照 Knorzer

13、等23方法，以基于NADPH的氧化作用在 340 nm下的吸光度的減少來衡量；蛋白質(zhì)含量的 測(cè)定以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford24的 方法.上述所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)有2個(gè)取樣 重復(fù)，重復(fù)3次測(cè)定.數(shù)據(jù)均表示為（L 土 s）.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 ABA對(duì)AtHsfAla突變型幼苗在冷脅迫下 MDA的影響MDA是膜脂過氧化后最重要的產(chǎn)物之一，其 濃度可以反映植物細(xì)胞膜遭受逆境傷害的程度.從 圖1可看出，在低溫下不同基因型擬南芥幼苗中 MDA濃度均升高，但突變型擬南芥（MT） MDA 的濃度較野生型（WT）高，在加入外源ABA處理 后，無論突變型還是野生型MDA的濃度都有所下 降，但突變型

14、下降幅度較小，表明外源ABA抑制 MDA的形成與熱激因子AtHsfAla呈正相關(guān)，說明 外源ABA和AtHsfAla協(xié)同降低MDA濃度，從而 降低低溫對(duì)細(xì)胞膜傷害.圖1 ABA對(duì)AtHsfAla在響應(yīng)冷脅迫中MDA濃度的影響2.2 ABA對(duì)AtHsfAla突變型幼苗在冷脅迫下 H2O2的影響過氧化氫（H2O2）作為一類重要的活性氧和 信號(hào)分子，其濃度的高低可以有效衡量細(xì)胞的受傷 程度.從圖2可看出，在常溫下2種基因型的 H2O2濃度差異不大，而在低溫脅迫下，突變型擬 南芥所含的H2O2濃度升高較野生型明顯，加入外 源ABA處理后不同基因型在低溫下擬南芥所含 H2O2都有一定程度降低，但突變型擬

15、南芥所含的 H2O2濃度降低較野生型小，說明外源ABA在低溫 下對(duì)H2O2濃度影響與熱激因子AtHsfAla有關(guān)，在 低溫下外源ABA和AtHsfAla協(xié)同降低了 。2濃 度，從而降低低溫產(chǎn)生活性氧的傷害.2. 3 ABA對(duì)AtHsfAla突變型幼苗在冷脅迫下抗氧 化酶的影響大量研究S#23發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶系統(tǒng)活性的增 強(qiáng)與提高植物的抗逆性密切相關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)，冷 脅迫處理可以使突變型和野生型植株SOD, CAT， GR和APX的活性不同程度升高（圖3），野生型 植株的抗氧化酶活性升高均明顯大于突變型植株的 抗氧化酶活性.外源ABA處理后對(duì)野生型植株的 抗氧化酶活性升高影響較大，而對(duì)突變型植株的

16、抗 氧化酶活性影響較?。▓D3a，3b，3c, 3d），表明 外源ABA提高抗氧化酶活性是與熱激因子AtHsfAla 有協(xié)同效應(yīng)，低溫下外源ABA和AtHsfAla協(xié) 同提高抗氧化酶活性而降低活性氧對(duì)植物的傷害， 從而提高植物的抗冷性.3結(jié)果與討論近年來，植物激素脫落酸（Abscisic acid， ABA）作為環(huán)境脅迫中的重要信號(hào)分子，能調(diào)控 一些熱激轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性m#，但ABA調(diào) 控?zé)峒まD(zhuǎn)錄因子后的生理生化過程尚有待于進(jìn)一步 地探討.熱激因子（Heat shock transcription factor， HSF）作為逆境信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要成員，它能(d)圖3 ABA對(duì)AtHsfA

17、la在響應(yīng)冷脅迫中抗氧化酶活性的影響直接啟動(dòng)下游防御基因（如熱激蛋白基因HSP、 抗壞血酸過氧化物酶APX等）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而 提高抗逆境的能力奸雖然，目前有研究 顯示，逆境誘導(dǎo)擬南芥熱激因子AtHsfAla在防御反 應(yīng)中發(fā)揮重要作用皿.然而，不清楚熱激因子 AtHsfAla在逆境應(yīng)答途徑上游感應(yīng)哪些逆境信號(hào), 而進(jìn)一步鑒定熱激因子響應(yīng)逆境的本質(zhì)與機(jī)理是研 究的趨勢(shì).大量研究+#囪表明，植物細(xì)胞在逆境 中反應(yīng)活性氧傷害程度的生理指標(biāo)丙二醛（MDA） 和過氧化氫（H2O2）等濃度會(huì)發(fā)生變化，而降低 逆境傷害的抗氧化酶系統(tǒng)也會(huì)積極參與，SOD、 CAT、GR和APX等作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要成 員，

18、在逆境中通過活性的增加來執(zhí)行降低活性氧的 生理功能使植物細(xì)胞受傷程度降到最低，從而提高 植物抗逆性.但植物逆境中ABA與熱激因子 AtHsfAla協(xié)同對(duì)逆境生理指標(biāo)的影響研究較少(d)圖3 ABA對(duì)AtHsfAla在響應(yīng)冷脅迫中抗氧化酶活性的影響為了研究ABA對(duì)擬南芥熱激因子AtHsfAla在 冷脅迫響應(yīng)中生理指標(biāo)的影響，本研究采用 AtHsfAla基因T-DNA插入的突變體及野生型的擬南 芥幼苗為材料，在冷脅迫下分析ABA突變體及野 生型植株的逆境生理生化指標(biāo)MDA、H2O2、SOD# CAT# GR和APX變化，同時(shí)探討擬南芥熱激因子 AtHsfAla在響應(yīng)冷脅迫中ABA的生理調(diào)控作用. 結(jié)果發(fā)