染色體G顯帶技術(shù)及其原理課件

1、 染色體G顯帶技術(shù) 及其原理 染色體G顯帶技術(shù) 及其原理 染色體G顯帶核型圖染色體G顯帶核型圖實(shí)驗(yàn)原理 (1) 人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標(biāo)本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間，或深淺不同帶紋的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)（banding technique）。本世紀(jì)70年代以來，顯帶技術(shù)得到了很大發(fā)展，且在眾多的顯帶技術(shù)中（Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶），G帶是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。因?yàn)樗饕潜籊iemsa染料染色后而顯帶，故稱之為G顯帶技術(shù)，其所顯示的帶紋分布在整個染色體上。實(shí)驗(yàn)原理 (1) 人們將用各種不同的方法，以實(shí)驗(yàn)原理(2) 研究發(fā)現(xiàn)，人染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶、Na0H

2、、檸檬酸鹽或尿素等試劑處理后，再用Giemsa染色，可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋，這就是染色體的G帶。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準(zhǔn)確的識別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細(xì)微的結(jié)構(gòu)畸變。實(shí)驗(yàn)原理(2) 研究發(fā)現(xiàn)，人染色體標(biāo)本經(jīng)Giemsa染料的發(fā)明者:Gustav Giemsa染色體G顯帶技術(shù)及其原理課件實(shí)驗(yàn)原理 (3) 關(guān)于G顯帶的機(jī)理目前有多種說法，例如，Lee等（1973）認(rèn)為染色體上與DNA結(jié)合疏松的組蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后這些區(qū)段成為淺帶，而那些組蛋白和DNA結(jié)合牢固的區(qū)段可被染成深帶。實(shí)驗(yàn)原理 (3) 關(guān)于G顯帶的機(jī)理目前有多種染色體G

3、顯帶技術(shù)及其原理課件實(shí)驗(yàn)原理 (4) 有人認(rèn)為，染色體顯帶現(xiàn)象是染色體本身存在著帶的結(jié)構(gòu)。比如用相差顯微鏡觀察未染色的染色體時，就能直接觀察到帶的存在。用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶更加清楚，隨顯帶方法不同，顯出來的帶特點(diǎn)也不一樣，說明帶的出現(xiàn)又與染料特異結(jié)合有關(guān)。實(shí)驗(yàn)原理 (4) 有人認(rèn)為，染色體顯帶現(xiàn)象是實(shí)驗(yàn)原理 (5) 一般認(rèn)為，易著色的陽性帶為含有AT多的染色體節(jié)段，相反，含GC多的染色體段則不易著色。顯帶方法的分子學(xué)基礎(chǔ)涉及核苷酸堿基組成、相關(guān)蛋白和基因組功能結(jié)構(gòu)。一般而言，吉姆薩陽性顯帶（G深帶，R淺帶）富含AT，復(fù)制較遲，基因較少；吉姆薩陰性顯帶（G淺帶，R深帶）富含GC，

4、復(fù)制較早，基因較多；總的來說，G顯帶的機(jī)理還未搞清。DNA核苷酸的組成 實(shí)驗(yàn)原理 (5) 一般認(rèn)為，易著色的陽性帶為實(shí)驗(yàn)原理(6) 非顯帶的標(biāo)本上雖然可以根據(jù)染色體的形態(tài)識別1，2，3，16，17和18號，有時還可以識別Y染色體，但卻不能有把握地鑒別其他大多數(shù)染色體。自1970年Caspersson等首次報道用喹吖因?qū)θ梭w染色體進(jìn)行染色可在各號染色體上顯現(xiàn)出寬窄和位置不同帶紋以來，細(xì)胞遺傳學(xué)工作者以不同的染色方法為基礎(chǔ)，提出了各種顯帶方法的名稱。實(shí)驗(yàn)原理(6) 非顯帶的標(biāo)本上雖然可以根據(jù)染實(shí)驗(yàn)原理(7) 如用芥子喹吖因作為染料,染出的熒光帶稱為Q帶,其方法稱為Q顯帶法;用Giemsa作為染料,

5、染出的帶稱為G帶,其方法稱為G顯帶法。同樣用Giemsa或其他熒光染料作為染料，但在其中加上不同的預(yù)處理而獲得的與Q帶或G帶著色強(qiáng)度正好相反的帶稱為R帶，其方法稱為反式顯帶法（R顯帶法）；將專一的顯示“結(jié)構(gòu)性異染色質(zhì)”的方法稱為C顯帶法，其帶稱為C帶。其它一些顯帶技術(shù)還可以專門顯示染色體的端粒（T顯帶）和核仁組織區(qū)（N帶）等。實(shí)驗(yàn)原理(7) 如用芥子喹吖因作為染料,染示中期染色體G顯帶結(jié)果 示中期染色體G顯帶結(jié)果 示中期染色體R顯帶結(jié)果 示中期染色體R顯帶結(jié)果 示中期染色體C顯帶結(jié)果 示中期染色體C顯帶結(jié)果 示中期染色體N顯帶結(jié)果 示中期染色體N顯帶結(jié)果 G顯帶是最常用的，染色體經(jīng)胰蛋白酶處理

6、后，使染色體的蛋白質(zhì)變性，然后用一種能結(jié)合DNA的化學(xué)染料吉姆薩染色，使染色體呈深淺不同的帶型，人類的24種染色體可顯示出各自特異的帶紋。實(shí)驗(yàn)原理(8) G顯帶是最常用的，染色體經(jīng)胰蛋白酶處理后實(shí)驗(yàn)用品(1) 1、材料： 常規(guī)方法制備的人外周血淋巴細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本(75中烤片3小時，未經(jīng)染色 )實(shí)驗(yàn)用品(1) 1、材料：實(shí)驗(yàn)用品(2) 2、器材： 顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、烤箱、恒溫水浴箱、冰箱、立式染色缸、鑷子、香柏油、擦鏡劑、擦鏡紙實(shí)驗(yàn)用品(2)實(shí)驗(yàn)用品（3） 3、試劑： 1) 2.5胰蛋白酶原液 2) 0.85生理鹽水 3) Giemsa儲存液 4) 115M磷酸緩沖液（1/15NA2HPO

7、4、 1/15KH2PO4） 5) 蒸餾水實(shí)驗(yàn)用品（3） 3、試劑：2.5胰蛋白酶原液的配制： 胰蛋白酶粉末（1:250）2.5g，100ml 生理鹽水，過濾除菌，分裝成1ml小瓶于 -20保存，用于消化細(xì)胞和染色體G顯帶標(biāo)本的制作。2.5胰蛋白酶原液的配制：生理鹽水的配制 氯化鈉（NaCl）8.5g，加三蒸水至1000ml，用溶液瓶分裝，高壓滅菌9 磅，10分鐘，可用于細(xì)胞培養(yǎng)。生理鹽水的配制Giemsa存儲液的配制 Giemsa粉末1g加少許甘油混合研碎共計(jì)加入甘油66ml，充分混勻倒入燒杯中在5560水浴中加熱2小時冷卻加入甲醇66ml，充分混合在室溫中靜置23周，過濾貯存于棕色瓶中，可

8、長期使用。 Giemsa存儲液的配制1/15mol/L 磷酸緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）的配制 甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液 Na2HPO4 9.465g 蒸餾水 加至1000ml 乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液 KH2P04 9.07g 蒸餾水 加至1000m1 分裝在瓶內(nèi)，于室溫保存，用時甲、乙兩液各按不同比例混合，即可得所需pH的緩沖液。染色體G顯帶技術(shù)及其原理課件pHM/15 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（9.47克/升）M/15 磷酸二氫鉀（KH2PO4）（9.08克/升）5.88.092.05.99.990.16.

9、012.287.86.115.384.76.218.681.46.322.477.66.426.773.36.531.868.26.637.562.56.743.556.56.849.650.46.955.444.67.061.138.97.166.633.47.272.028.07.376.823.27.480.819.27.584.115.97.687.013.07.789.410.67.891.58.57.993.26.88.094.75.38.195.84.28.297.03.0pHM/15 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（9.47克/升）2SSC溶液的配制 用分析天平稱取氯化鈉17.5

10、3克，檸檬酸鈉8.82克溶于蒸餾水中，加蒸餾水至1000毫升。2SSC溶液的配制實(shí)驗(yàn)方法(一) 胰蛋白酶消化法(二) 胰蛋白酶EDTA法(三)(Acetic-saline-Giemsa)法實(shí)驗(yàn)方法(一) 胰蛋白酶消化法(一) 胰蛋白酶消化法1. 準(zhǔn)備常規(guī)方法制備的人外周血淋巴細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本，置75 烤箱中預(yù)熱5分鐘。2. 在立式染色缸中加磷酸緩沖液100ml（ 115M NaH2PO4 80.8 ml ，KH2PO4 19.2ml)，再加入2.5的胰蛋白酶原液1ml配成終濃度為0.025的工作液。(一) 胰蛋白酶消化法1. 準(zhǔn)備常規(guī)方法制備的人外周血淋巴(一) 胰蛋白酶消化法3.將配好的胰

11、蛋白酶工作液放入37水浴箱中預(yù)熱。4.將玻片標(biāo)本浸入胰蛋白酶中，不斷擺動使胰蛋白酶的作用均勻，處理11.5分鐘（精確的時間自行摸索）。5.立即取出玻片，放入生理鹽水中漂洗兩次。(一) 胰蛋白酶消化法3.將配好的胰蛋白酶工作液放入37(一) 胰蛋白酶消化法6. 染色。將標(biāo)本浸入37預(yù)溫的Giemsa染液（將Giemsa儲存液3ml加蒸餾水47ml稀釋即可）中染色10分鐘左右。7.自來水沖洗、自然晾干或吹干。(一) 胰蛋白酶消化法6. 染色。將標(biāo)本浸入37預(yù)溫的G(一) 胰蛋白酶消化法8. 鏡檢顯帶效果。在低倍鏡下選擇分散良好的長度適中的分裂相轉(zhuǎn)換油鏡觀察，若染色體未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不足；若染色

12、體邊緣發(fā)毛為顯帶過頭，此時應(yīng)根據(jù)具體情況增減胰蛋白酶處理時間重新處理一張標(biāo)本。(一) 胰蛋白酶消化法8. 鏡檢顯帶效果。在低倍鏡下選擇(二)胰蛋白酶EDTA法 1. 將25ml生理鹽水和25ml0.02%EDTA溶液倒入立式染色缸內(nèi)。2. 取2.5%胰蛋白酶溶液lml加入上液內(nèi)混勻，滴入12滴1M氫氧化鈉溶液至上液中，使pH達(dá)7.07.2。3. 將配制好的胰蛋白酶溶液置37水浴箱中預(yù)熱5分鐘。(二)胰蛋白酶EDTA法 1. 將25ml生理鹽水和25(二)胰蛋白酶EDTA法 4. 取染色體標(biāo)本片，置入胰蛋白酶溶液中，輕輕搖動60180秒。立即在生理鹽水中漂洗兩次。5. 以Giemsa染色510分

13、鐘（37）后，用自來水沖洗、晾干。(二)胰蛋白酶EDTA法 4. 取染色體標(biāo)本片，置入胰蛋(二)胰蛋白酶EDTA法 6. 鏡檢判斷顯帶效果，在低倍鏡下選擇分散良好，長度適中的分裂相，再轉(zhuǎn)至油鏡下觀察。若染色體邊緣發(fā)毛，為顯帶過度；若染色體未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不足。這時應(yīng)根據(jù)具體情況再試一張標(biāo)本片，適當(dāng)增減胰蛋白酶處理的時間，直到滿意為止。(二)胰蛋白酶EDTA法 6. 鏡檢判斷顯帶效果，在低倍(三)(Acetic-saline-Giemsa)法 1用甲醇、冰醋酸固定液固定，空氣干燥法制片的標(biāo)本。 2浸入2SSC溶液中，60溫育1小時。 3蒸餾水沖洗。 41/20Giemsa染液染色1小時。 5

14、水洗后涼干鏡檢。 (三)(Acetic-saline-Giemsa)法 注意事項(xiàng)玻片完全干后，才可置油鏡下進(jìn)行觀察。每次顯帶均應(yīng)做預(yù)實(shí)驗(yàn)處理，以決定正確的顯帶時間，不可盲目處理所有玻片。顯帶效果的判斷，應(yīng)多觀察幾個長度適中的分裂相,不能僅憑1、2個分裂相的顯帶效果決定下一步顯帶時間。注意事項(xiàng)玻片完全干后，才可置油鏡下進(jìn)行觀察。影響G顯帶的一些因素（1） 許多因素會影響G顯帶能否成功。因此并無一成不變的定規(guī)，人們?nèi)绻莒`活地掌握這些因素，就照樣會獲得優(yōu)良的效果。G顯帶成敗之關(guān)鍵取決于胰蛋白酶的濃度和處理時間之搭配，但以下因素也有一定的影響： 影響G顯帶的一些因素（1） 許多因素會影響G影響G顯帶

15、的一些因素（2） 制作標(biāo)本的方法 火燒干燥法制得的標(biāo)本對胰蛋白酶處理的抵抗力較氣干法標(biāo)本要強(qiáng)些。 標(biāo)本的年齡 標(biāo)本保存的時間越長，細(xì)胞對胰蛋白酶處理的抵抗性越大。片齡很長的標(biāo)本往往導(dǎo)致斑點(diǎn)狀（而不是帶紋）的染色體。影響G顯帶的一些因素（2） 制作標(biāo)本的方法影響G顯帶的一些因素（3） 胰蛋白酶液中的鹽類成分 溶液中的二價陽離子會使反應(yīng)減慢，但并不能阻止這種反應(yīng)。影響G顯帶的一些因素（3） 胰蛋白酶液中的鹽類成分影響G顯帶的一些因素（4） 胰蛋白酶液的溫度 溫度較高，這種反應(yīng)的速度就較快。當(dāng)然，在有空調(diào)的實(shí)驗(yàn)室中，最合適的溫度是室溫。胰蛋白酶的溫度在進(jìn)行顯帶之前應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定在室溫至少30分鐘。對于缺乏

16、室溫控制的實(shí)驗(yàn)室，也有把胰蛋白酶溫度穩(wěn)定在4的，有的甚至把胰蛋白酶液放在冰箱中。在溫度較低的情況下，應(yīng)當(dāng)延長處理的時間。如能把所有條件穩(wěn)定下來，則可得到一致的效果。影響G顯帶的一些因素（4） 胰蛋白酶液的溫度影響G顯帶的一些因素（5） 胰蛋白酶處理的時間 這當(dāng)然取決于上面所有這些因素，但一般推薦處理的時間不宜少于30秒鐘。 影響G顯帶的一些因素（5） 胰蛋白酶處理的時間影響G顯帶的一些因素（6） 無論是用胰蛋白酶法還是EDTA-胰蛋白酶法，均可得到良好而穩(wěn)定的效果。中期分裂相中的絕大多數(shù)（有時超過90%）細(xì)胞都顯示出良好的G帶。為了在同一標(biāo)本上顯示不同的帶型，例如Q帶和G帶，那末應(yīng)當(dāng)先作Q帶，

17、然后同一標(biāo)本還可作C帶染色。在摸索胰蛋白酶處理的時間時，可在同一玻片上分別摸索2-3個時間，經(jīng)染色后即在鏡下觀察。如果細(xì)胞呈藍(lán)紫色（與常規(guī)染色相似）說明胰蛋白酶的作用時間不夠；如細(xì)胞的色澤為桃紅色，那就差不多了。影響G顯帶的一些因素（6） 無論是用胰蛋染色體G顯帶失敗標(biāo)本的補(bǔ)救方法(1) 染色體標(biāo)本的G顯帶是細(xì)胞遺傳學(xué)最主要的顯帶方法。但G顯帶常常由于操作者的不當(dāng)導(dǎo)致顯帶不夠，不能進(jìn)行準(zhǔn)確的核型分析。在工作中，可用無水乙醇和甲醇：乙酸(3：1)固定液對由于胰蛋白酶消化時間短而致的失敗標(biāo)本進(jìn)行重新處理。染色體G顯帶失敗標(biāo)本的補(bǔ)救方法(1) 染色體染色體G顯帶失敗標(biāo)本的補(bǔ)救方法(2)無水乙醇脫色法 將未經(jīng)油鏡觀察后無香柏油的標(biāo)本片放人無水乙醇中漂洗12 min，放75烤箱烘烤10