醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 第02章 研究方法課件

1、Hela cell研究方法和手段醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 1.光學(xué)顯微鏡2.電子顯微鏡 3.掃描探針顯微鏡100m100nm1 nm一、顯微技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡微分干涉差顯微鏡熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡最大分辨率，0.2um原理：利用一組透鏡將標(biāo)本連續(xù)放大。一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡分辨率或分辨力在人的明視距離25cm處，能清楚的分辨兩點(diǎn)的最小間隔的能力，用R來(lái)表示。R=0.61 /nsin 光線名稱可見(jiàn)光紫外光0.1kv電子束10kv電子束100kv電子束波長(zhǎng)nm390760133900.1230.01220.00387一、

2、顯微技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡標(biāo)本制備：取材固定染色觀察直接涂片甲醛、戊二醛、乙醇包埋切片(固定)普通光學(xué)顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡口腔上皮細(xì)胞血細(xì)胞Fulgen染色神經(jīng)母細(xì)胞10X4010X60倒置相差顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡倒置相差顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡原理：物鏡標(biāo)本分光鏡濾光片濾光片光 源： 紫外光 標(biāo)本內(nèi)的熒光分子：標(biāo)本自身含有熒光物質(zhì)用熒光物質(zhì)標(biāo)記標(biāo)本檢測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)特定的抗原 應(yīng)用：特點(diǎn)：熒光顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡原理：激光共聚焦掃描顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡共聚焦針孔物鏡的焦平面光源針孔物鏡檢測(cè)器分光鏡激光光

3、源激光共聚焦掃描顯微鏡一、顯微技術(shù)1.光學(xué)顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡一、顯微技術(shù)2.電子顯微鏡透射電子顯微鏡成像原理: 電子束穿透樣本而成像應(yīng)用: 觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)一、顯微技術(shù)2.電子顯微鏡透射電子顯微鏡一、顯微技術(shù)2.電子顯微鏡透射電子顯微鏡一、顯微技術(shù)2.電子顯微鏡標(biāo)本的制備：固定包埋切片染色（重金屬鹽）觀察1)光源 2)透鏡 3)成像原理 4)標(biāo)本處理 與光學(xué)顯微鏡比較:透射電子顯微鏡一、顯微技術(shù)2.電子顯微鏡極細(xì)的電子“探針”掃描樣品表面，收集二次電子成像。主要觀察樣品的表面三維形態(tài)結(jié)構(gòu)。掃描電子顯微鏡 成像原理主要應(yīng)用掃描電子顯微鏡一、顯微技術(shù)2.電子顯微鏡帶有冠細(xì)胞的人

4、類卵子卵子表面的精子掃描電子顯微鏡一、顯微技術(shù)2.電子顯微鏡細(xì)胞分離方法:破壞胞外基質(zhì)和細(xì)胞間的連接細(xì)胞懸液?jiǎn)我环N類細(xì)胞離心或者吸附性差異蛋白酶消化機(jī)械剪切消化、機(jī)械并用二、細(xì)胞的分離和培養(yǎng)1.從組織中分離皮膚瘢痕小鼠胸腺骨髓間質(zhì)干細(xì)胞平滑肌細(xì)胞成纖維細(xì)胞T細(xì)胞大鼠骨髓平滑肌研磨、過(guò)濾、離心吸附培養(yǎng)瓶底剪碎、蛋白酶、離心附在瓶壁爬出來(lái)二、細(xì)胞的分離和培養(yǎng)1.從組織中分離流式細(xì)胞儀應(yīng)用：1)分選細(xì)胞2)細(xì)胞表型分析3)染色體分析4)DNA分析二、細(xì)胞的分離和培養(yǎng)2.細(xì)胞分選（cell sorting）基本原理：激光 在一定的營(yíng)養(yǎng)條件下將細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之繼續(xù)生長(zhǎng)增殖的過(guò)程。 基本材料與器材

5、：培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基，血清，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，倒置顯微鏡二、細(xì)胞的分離和培養(yǎng)3.細(xì)胞培養(yǎng)（ cell culture ）超凈工作臺(tái)CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作細(xì)胞體外生長(zhǎng)的條件:1）需要營(yíng)養(yǎng);2）適宜溫度、濕度;3）適宜的pH值;4）無(wú)菌的環(huán)境以及支持物.二、細(xì)胞的分離和培養(yǎng)3.細(xì)胞培養(yǎng)（ cell culture ）傳代培養(yǎng)( subculture cell) ：將細(xì)胞按一定的比例轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。原代培養(yǎng)(primary culture cell)：直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織 和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。二、細(xì)胞的分離和培養(yǎng)3.細(xì)胞培養(yǎng)（ cell culture ）細(xì)胞系中挑出一個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)形

6、成的克隆。 原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)傳代成后就叫細(xì)胞系 。細(xì)胞系(cell line)：細(xì)胞株(cell strain)：二、細(xì)胞的分離和培養(yǎng)3.細(xì)胞培養(yǎng)（ cell culture ）細(xì)胞系/株細(xì)胞株類型細(xì)胞株名稱代號(hào)價(jià)格人腫瘤乳癌MCF-7400宮頸癌Hela400動(dòng)物腫瘤大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤 PC-12 400小鼠骨髓瘤 SP2/0 400正常動(dòng)物細(xì)胞鼠胚胎成纖維細(xì)胞 3T3-Swiss 400NIH Swiss鼠肺成纖維細(xì)胞 NIH/3T3 400倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CHO 400正常人細(xì)胞人胚腎細(xì)胞 HEK293 400人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC 500破壞細(xì)胞膜低滲超聲振蕩機(jī)械研磨各種細(xì)胞器及大分子

7、離心層析電泳生物質(zhì)普技術(shù)勻漿三、細(xì)胞組分的分級(jí)分離 其他分子生物學(xué)技術(shù)離心分離技術(shù)：差速離心移動(dòng)區(qū)帶離心分離細(xì)胞器、生物大小分子常用的技術(shù)，根據(jù)各種顆?；虼蠓肿拥拇笮?、密度的不同進(jìn)行分離。等密度離心三、細(xì)胞組分的分級(jí)分離 速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀 差速離心低速較高速高速離心分離技術(shù)：三、細(xì)胞組分的分級(jí)分離 等密度離心移動(dòng)區(qū)帶離心細(xì)胞融合技術(shù)四、細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞核移植技術(shù)干細(xì)胞研究技術(shù)指兩種不同類型的細(xì)胞在滅活病毒或者PEG處理下融合成為一個(gè)異核體，經(jīng)過(guò)有絲分裂后兩個(gè)核也融成一個(gè)核，形成雜交細(xì)胞。細(xì)胞融合技術(shù)四、細(xì)胞工程技術(shù)英國(guó)人Kohler和Milstein1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1