Western Blot蛋白免疫印跡法

1、3Westernblot3.1試劑配制1）30%聚丙烯酰胺儲備液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）,29g；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）,1g,去離子水溶解，37水浴助溶，定容至100mL。0.45Mm濾器過濾，棕色瓶4避光保存。2）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：SDS，10g；H2O，80mL。68加熱溶解，濃HCl調(diào)pH至7.2，定容至100mL，室溫保存。3）10%過硫酸銨（AP）：AP，1g；H2O，10mL。避光，4保存。（42周）4）分離膠緩沖液（1.5MTris-HClpH8.8）：Tris，18.17g；H2O80mL。用濃HCl調(diào)pH至8.8，定容至100mL，4

2、保存。5）濃縮膠緩沖液（1.0MTris-HClpH6.8）：Tris，12.11g；H2O80mL。用濃HCl調(diào)pH至6.8，定容至100mL，4保存。6）電泳緩沖液（10義）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris30.2g；SDS，10g；H2O,800mL。調(diào)節(jié)pH至8.3,定容至1L,4保存（用時稀釋為1義）。5義SDSloadingBuffer（5mL）:1MTris-HCl（pH6.8）,1.25mL；SDS,0.5g；溴酚藍(lán)（BPB）,25mg；甘油，2.5mL；加去離子水定容至5mL。充分混勻，分裝成500mL/份，室溫保存。使用前每份加入25MLp-巰基乙醇（2-ME

3、）,加入2-ME的loadingbuffer可在室溫下保存一個月左右。8）考馬斯亮藍(lán)染色固定液：40%雙蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室溫保存9）考馬斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)R-250,250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O,定容至100ml。室溫保存。10）考馬斯亮藍(lán)染色脫色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O850ml，充分混合，室溫保存11）膜轉(zhuǎn)移緩沖液：甘氨酸，2.9g；Tris,5.8g；SDS,0.37g；力口H2O600mL充分溶解，加200mL甲醇，混勻，定容至1匕，室溫保存。TBS緩沖液：NaCl,8.8g；1MTis-HCL（pH8.0）,20ml,

4、加入約800H2O攪拌溶解，定容至1L,4保存。TBST緩沖液：NaCl,8.8g；1MTis-HCL(pH8.0),20ml,加入約800H2O攪拌溶解，加入0.5mlTween20后充分混勻，去離子水定容至1L,4保存。1MTis-HCL(pH8.0)Tris.1g置于1L燒杯，加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢?，加入濃HCL約42ml，定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。3.2Westernblot電泳、轉(zhuǎn)膜及顯色過程清洗將玻璃板洗凈，用ddH2O沖洗，然后晾干。封板時保證支架與底座膠條契合，固定時兩邊同時均勻用力旋動齒輪把手，固定即可，不要用力過大以免壓碎玻璃。封好后可裝ddH2O試試，確

5、定不漏后再灌膠。2、制膠SDS分離膠配方表(12%Gel)各種組分名稱各種凝膠體積對應(yīng)的各種組分的取樣量(ml)10ml15ml20mlH2O3.34.96.630%Acrylamide4.06.08.01.5MTris-Hcl(pH8.8)2.53.85.010%SDS0.10.150.210%過硫酸銨(AP)0.10.150.2TEMED0.0040.0060.008SDS濃縮膠(5%Acrylamide)配方表各種組分名各種凝膠體積對應(yīng)的各種組分的取樣量(ml)稱4ml5ml6mlH2O2.73.44.130%Acrylamide0.670.831.01.0MTris-Hcl0.50.6

6、30.75(pH6.8)10%SDS0.040.050.0610%過硫酸銨（AP）0.040.050.06TEMED0.0040.0050.0063、封膠按前面方法配分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了（至少等30-40min）。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面方法配5%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。

7、將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。4、拔梳子灌好濃縮膠，約40-60min凝膠后均勻用力拔除梳子，若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正。5、上樣測完蛋白濃度后，計算含M蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至5離心管中，加入5義5口5上樣緩沖液至終濃度為1X。將加入loadingbuffer的蛋白樣品放沸水中煮5-10分鐘，高速離心30s即可上樣。上樣總體積一般不超過15Pl加樣孔的最大限度可加p體積。加足夠的電泳

8、液后開始準(zhǔn)備上樣，電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板，外側(cè)漠過底部。所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的Ixloadingbuffer上樣。非預(yù)染蛋白準(zhǔn)備：1Dp與5Xp混合成稀釋液p然后再加入（）5p、滅菌蒸餾水p混合成蛋白混合均勻后，煮沸處理5i分裝保存，取5p進(jìn)行1凝膠電泳。6、電泳先穩(wěn)流30mA電泳至上下膠分界時改穩(wěn)流45mA直接調(diào)總時間1.5h，到時候直接調(diào)電流。當(dāng)loadingbuffer泳動到膠下緣時結(jié)束。電泳時間較長時，應(yīng)用冰塊放電泳槽兩邊防止溶膠。7、轉(zhuǎn)膜剝膠：輕啟玻璃板，將膠卸下，切除濃縮膠及無用膠，右上切角標(biāo)記，在冷的電轉(zhuǎn)液中平衡20-60min。材料準(zhǔn)備：

9、轉(zhuǎn)一張膜需要2張濾紙（伯樂專用濾紙）和1張0.45umPVDF膜，切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸才可使用。用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。處理：將與膠同樣大小的濾紙放在轉(zhuǎn)移液中浸泡片刻，PVDF膜需浸泡甲醇1-2min，再孵育于冰的電轉(zhuǎn)液中5min。電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜：A、打開保護(hù)罩，按照如下準(zhǔn)備凝膠三明治：B、從底部鉑金正極開始放置：預(yù)濕-濾紙預(yù)濕-膜已平衡的膠預(yù)濕-濾紙注意：每層之間趕走氣泡C、連接頂部不銹鋼陰

10、極，蓋上保護(hù)罩D、不同蛋白需要不同優(yōu)化的條件：參考范圍：小膠10V30min或者15V15min大膠25V30min或者15V60min注意：當(dāng)前不要超過25V，且大膠不要超過3mA/cm2、小膠不要超過5.5mA/cm2E、關(guān)閉電源，拔掉電極，移除膠注：為了防止溶膠，可將轉(zhuǎn)移緩沖液提前放4冰箱預(yù)冷過夜膜上蛋白檢測：麗春紅2%的麗春紅儲備液（1X）:0.4g麗春紅、6g三氯乙酸、6g磺基水楊酸溶于20ml。麗春紅染色工作液：2%的麗春紅儲備液1:10稀釋，即加9倍的ddH2O染色方法：將膜放入洗一次，再置于麗春紅染色工作液中，在室溫下?lián)u動染色分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色，marker條帶處

11、用鉛筆做好標(biāo)記?；厥漳ば栌眉状荚倩罨笥孟春筮M(jìn)行封閉。8膜的封閉膜用洗完后，移至含有封閉液加入一定量的磷酸酶抑制劑的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉。再用洗秒，進(jìn)入下一步抗體的孵育。配制脫脂奶粉或溶液：每中加入脫脂奶粉或，混勻后過濾，如不過濾會導(dǎo)致膜污染上細(xì)微黑顆粒。9一抗的孵育一抗的準(zhǔn)備：將一抗按適當(dāng)?shù)谋壤每贵w稀釋液稀釋。加入一定量的磷酸酶抑制劑孵訕曲：按抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋一抗。一般參考推薦的稀釋倍數(shù)1:100-1:3000，1:1000一抗?jié)舛冗^高會導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶。將PVDF膜浸沒于含有一抗的抗體稀釋液中室溫（25左右）輕搖3小時或放4冰箱過夜。若放入4冰箱過

12、夜則第二天還應(yīng)放室溫緩慢搖蕩1小時。o洗滌：一抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后應(yīng)換容器浸洗），每次10min，以去除殘留的一抗。洗滌結(jié)束后進(jìn)行二抗的孵育。11、二抗的孵育孵育buffer和稀釋倍數(shù):用TBST按說明書推薦的倍數(shù)稀釋二抗。常規(guī)稀釋倍數(shù)1:1000-1:20,0001:1000，二抗的濃度過高也會導(dǎo)致非特異性條帶。根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗（HRP標(biāo)記），按相應(yīng)比例用抗體稀釋液稀釋，室溫輕搖1-2小時。12、洗滌:二抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后應(yīng)換容器），每次10min，最后用TBS清洗一次。注：抗體稀釋液稀釋的一抗或二抗可回收重復(fù)利用數(shù)次，抗體稀釋液稀釋后的抗體可4保存約半個月時間。13、顯色-辣根過氧化物酶顯色試劑盒（生工）溶液A在使用之前，37溫育10分鐘，以免產(chǎn)生沉淀。在免疫印跡實驗中，先將相應(yīng)的HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的二抗覆蓋膜后，在37的情況下，于震蕩器搖床上，震蕩輕搖一個半