基因工程操作

基因工程

第四節(jié)

基本操作過程第一頁，共一百一十七頁。1供體+載體重組體受體工程細(xì)胞分子水平細(xì)胞水平

分切連

轉(zhuǎn)篩表

基因工程的四類技術(shù)：提取，重組，轉(zhuǎn)移，表達(dá)基因工程的三個要素：供體，載體，受體第二頁，共一百一十七頁。2一、分離：提取、制備目的基因和載體DNA（一）目的基因概論1.目的基因的定義：目的基因指基因工程要克隆和表達(dá)的靶基因，要獲得該基因產(chǎn)物的目標(biāo)基因。因為多來自另一不同生物基因組，故稱外源目的基因。2.目的基因要求：

必須獲得高純度、足數(shù)量、質(zhì)完整的目的基因，才能克隆、擴(kuò)增和表達(dá)出目的基因產(chǎn)物。

第三頁，共一百一十七頁。33.目的基因的用途：理論上①研究基因結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控；②研究生物進(jìn)化及相關(guān)同源性；③與正?；虮容^，查出異常，確定疾病基因。

應(yīng)用上①基因工程大量表達(dá)目的蛋白質(zhì)，多肽和酶；②為基因治療，基因預(yù)防提供正常目的基因；③在農(nóng)、林、牧、漁業(yè)中，改進(jìn)良種等。

第四頁，共一百一十七頁。4從生物基因組中分離目的基因

原核生物基因組較小，基因容易定位，用限制性內(nèi)切酶將基因組切成若干段后，用帶有標(biāo)記的核酸探針，從中選出目的基因。真核生物一般通過基因組文庫的方法獲得目的基因。從mRNA獲得目的基因從基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA來反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為目的基因，也可通過cDNA文庫的方法獲得目的基因。其他方法（見后）4.目的基因的獲得：第五頁，共一百一十七頁。5（二）構(gòu)建DNA文庫基因組文庫（genomiclibrary）

（含有全部基因）cDNA文庫（complementaryDNAlibrary）（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）第六頁，共一百一十七頁。6

基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片斷的重組DNA克隆群體。1.基因組文庫的構(gòu)建第七頁，共一百一十七頁。7

提取基因組DNA，采用限制酶將基因組DNA切割成片段，每一DNA片段都與一個載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的集合體，這樣一個集合體稱為基因組文庫。這種保存了該種生物所有遺傳信息文本，就如圖書館，用時隨時抽取。通過雜交篩選獲得特定的基因片段。第八頁，共一百一十七頁。8

細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文庫的構(gòu)建

細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序第九頁，共一百一十七頁。9基因文庫的構(gòu)建圖第十頁，共一百一十七頁。10

理想的基因組文庫中

所有克隆DNA片段的總和應(yīng)為整個基因組的DNA序列?？寺∨c克隆之間應(yīng)有重疊序列。

第十一頁，共一百一十七頁。11個體的所有細(xì)胞均具有相同的基因組結(jié)構(gòu)，但在同一機(jī)體不同類型的細(xì)胞或同一細(xì)胞在生長發(fā)育的不同階段，以及受到不同因素（物理、化學(xué)或生物因素）的刺激，基因表達(dá)的種類與數(shù)量是不同的。2.cDNA文庫的構(gòu)建第十二頁，共一百一十七頁。12

cDNA文庫是某種特定細(xì)胞及特定狀態(tài)下的全部cDNA克隆。只有在細(xì)胞內(nèi)存在mRNA，才能建成相應(yīng)的cDNA文庫，所以不同種類及不同狀態(tài)的細(xì)胞有不同的cDNA文庫。第十三頁，共一百一十七頁。13構(gòu)建cDNA文庫前，必須先從細(xì)胞中提取高質(zhì)量的mRNA。因mRNA有poly（A）尾巴，可用12～18寡聚d（T）片段作為引物，加入4種dNTP，AMV（或MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶催化第一股鏈的合成。第十四頁，共一百一十七頁。14用RNaseH去掉mRNA，剩下的單鏈DNA的3′端往往有自發(fā)回折（原因不明）形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，正好可以作為合成第二條DNA鏈的引物。由T4DNA聚合酶催化第二股鏈的合成，即得到雙鏈cDNA的混合體。采用SI核酸酶處理，可得到平端的雙鏈cDNA，然后再與載體進(jìn)行連接。第十五頁，共一百一十七頁。15將cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個cDNA分子都與一個載體分子拼接成重組DNA。將得到的所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的集合體，這樣一個集合體就稱為cDNA文庫（cDNAlibrary）。完成DNA重組后可通過雜交篩選獲得特定的cDNA克隆。第十六頁，共一百一十七頁。16cDNA克隆的制作過程第十七頁，共一百一十七頁。17基因組DNA文庫和cDNA文庫的構(gòu)建第十八頁，共一百一十七頁。18

（三）制備目的基因的方法

1.從文庫中提取

在已建立的基因組文庫、cDNA文庫中取得目的基因的克隆，提取DNA，經(jīng)限制酶切下，插入到相關(guān)載體。

第十九頁，共一百一十七頁。19

用分子雜交的方法從基因文庫中釣取目的基因第二十頁，共一百一十七頁。20

（2）從基因組DNA直接切取

對一些相對小的基因組，其物理圖譜已經(jīng)確定，背景資料清楚的原核生物、病毒等基因組，可直接用限制酶消化后，電泳分離獲得目的基因片段?？梢詮钠渌芽寺〉馁|(zhì)粒上用限制酶切下，再插入到有關(guān)載體上。第二十一頁，共一百一十七頁。21（3）用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增有關(guān)DNA片段

用PCR技術(shù)可以在體外有效而且特異地擴(kuò)增目的基因片段。在已知序列的前提下，可以采用RT-PCR方法直接從mRNA獲得特定基因的cDNA。也可從已有的cDNA克隆中擴(kuò)增出編碼區(qū)的DNA片段，用于構(gòu)建表達(dá)載體。因為PCR有一定錯配率，必須用測序予以確認(rèn)。第二十二頁，共一百一十七頁。22

（4）化學(xué)合成

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列應(yīng)用：一般用于小分子肽類基因的合成使用DNA合成儀合成的片段長度有限，較長的鏈則須分段合成，然后用連接酶進(jìn)行連接。第二十三頁，共一百一十七頁。23（四）載體的選擇和制備λ噬菌體和粘性質(zhì)粒適用構(gòu)建基因組文庫。pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建cDNA文庫和克隆一些較小的DNA片段。M13噬菌體則用于克隆一些待測序的DNA片段。第二十四頁，共一百一十七頁。24

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。第二十五頁，共一百一十七頁。25

無論選用何種載體，首先都要獲得載體分子，即分離純化λ噬菌體DNA或制備粘性質(zhì)粒和其它有關(guān)質(zhì)粒。獲得載體后，采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割，獲得線性分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。第二十六頁，共一百一十七頁。26二、酶切獲得目的基因和載體DNA之后，為了進(jìn)行重組，必須對它們進(jìn)行酶切或加上接頭，在線性狀態(tài)下，為連接作好準(zhǔn)備，應(yīng)注意工具酶的選擇保證連接成功。第二十七頁，共一百一十七頁。27

三、連接不同來源的DNA片段通過限制酶切斷或機(jī)械力剪切后，可以在體外重新連接起來，形成人工重組體。體外連接的方法主要有以下四種。第二十八頁，共一百一十七頁。28

1.粘性末端連接

大多數(shù)限制酶錯位切斷DNA分子，產(chǎn)生5′或3′粘性末端，如果用同一種酶消化載體和目的DNA分子，或者載體DNA和目的DNA雖然用不同的酶處理，但能產(chǎn)生相同的粘性末端，那么DNA片段之間很容易按照堿基配對關(guān)系退火，互補的堿基以氫鍵相結(jié)合。在T4DNA連接酶的作用下，其末端以磷酸二酯鍵相連接，成為環(huán)狀DNA重組體。第二十九頁，共一百一十七頁。29由于載體DNA經(jīng)一種限制酶切割后，其兩端的堿基序列互補，因而線性的載體DNA可以自身環(huán)化，形成空白載體，使DNA重組體的比例下降，為目的基因的篩選帶來困難。避免方法之一是將載體DNA在限制酶切割之后，用堿性磷酸酶處理，除去5′磷酸基團(tuán)。這樣載體DNA不能自身環(huán)化，只能與未經(jīng)堿性磷酸酶處理的外源DNA片段連接。第三十頁，共一百一十七頁。30第三十一頁，共一百一十七頁。312.利用人工接頭（linker）連接

某些限制酶如HaeⅢ、SmaⅠ等切割DNA可產(chǎn)生平末端，機(jī)械力剪切的DNA以及cDNA等也是平端，這種情況采用人工合成的接頭進(jìn)行連接比較有效。接頭指含有某些限制酶切點的寡核苷酸片段，在T4DNA連接酶的作用下，將接頭連接到目的DNA片段的兩端，然后再用相應(yīng)的限制酶切割，這樣外源DNA片段的兩端具有了粘性末端，可以連接到用同一限制酶線性化了的載體上去。第三十二頁，共一百一十七頁。32人工接頭(linker)連接CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ第三十三頁，共一百一十七頁。33

3.加入同聚體尾連接

將目的DNA片段用λ外切核酸酶作有限消化或者用能產(chǎn)生3′粘性末端的限制酶（如PstⅠ）消化，生成具有3′-OH的單鏈末端。暴露出來的3′-OH末端是末端轉(zhuǎn)移酶的良好底物，該酶可將某種單一脫氧核苷酸逐一加到3′-OH上去，生成某一脫氧核苷酸的同聚體尾。第三十四頁，共一百一十七頁。34載體質(zhì)粒用能產(chǎn)生3′粘性末端的限制酶消化生成3′粘性末端，在反應(yīng)體系中加入互補的單一脫氧核苷酸，在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下產(chǎn)生與目的基因末端同聚體尾互補的同聚體尾，將目的DNA片段與載體混合，兩種DNA分子通過互補的同聚體尾形成氫鏈，末端間的空隙在導(dǎo)入宿主菌后，可在細(xì)菌體內(nèi)有關(guān)酶的作用下自行修復(fù)。第三十五頁，共一百一十七頁。35同聚物加尾連接T(T)nT3′3′T(T)nTA(A)nA3′T(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶重組體5′3′3′5′載體DNA限制酶5′3′3′5′λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dTTP5′5′5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切5′

3′3′5′λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP5′5′3′

A(A)nA第三十六頁，共一百一十七頁。36

（4）平端連接

不同方式產(chǎn)生的平端DNA片段可以在T4DNA連接酶的作用下，與某些限制酶產(chǎn)生的平端載體相連接。為提高連接效率，在連接這樣的DNA片段時，所用的ATP及T4DNA連接酶的濃度比粘性末端要高些。第三十七頁，共一百一十七頁。37

（5）T-A克隆

T-A克隆是一種對PCR產(chǎn)物直接克隆的技術(shù)。PCR反應(yīng)，擴(kuò)增的目的DNA產(chǎn)物兩端被TaqDNA聚合酶加兩個A，這不依賴模板。把載體斷口人工加兩個T，測產(chǎn)物和載體可以連接。第三十八頁，共一百一十七頁。38T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A第三十九頁，共一百一十七頁。39（6）定向克隆(directlycloning)

把外源目的基因定向插入到載體分子中的克隆方案叫定向克隆。定向克隆在構(gòu)造表達(dá)載體系統(tǒng)時很重要，保證方向正確，才能正確表達(dá)。定向克隆有兩種連接方式：①用兩個不同粘性末端的酶切割目的基因和載體DNA，產(chǎn)生非同源粘末端，保證定向，粘-粘連接。②用一側(cè)平端，一側(cè)為粘性末端，粘-平連接，保證方向正確。第四十頁，共一百一十七頁。40EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶重組體定向克隆可有效避免載體自連和DNA片段的反向插入第四十一頁，共一百一十七頁。41四、轉(zhuǎn)移：將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

常用的方法有：

轉(zhuǎn)化（transformation）

質(zhì)?；蝠ち！?xì)菌（感受態(tài)細(xì)胞，competentcell）質(zhì)?！湍妇ㄕ婧思?xì)胞）轉(zhuǎn)染（transfection）外源DNA→真核細(xì)胞（酵母除外）噬菌體DNA→感受態(tài)細(xì)菌感染（infection）噬菌體顆?！?xì)菌病毒顆?！溉榧?xì)胞第四十二頁，共一百一十七頁。42（一）轉(zhuǎn)化（transformation）

指將質(zhì)粒或其它外源DNA導(dǎo)入處于感受狀態(tài)的宿主細(xì)菌/細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)化常用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。轉(zhuǎn)化的方法很多，常用的是氯化鈣法、電穿孔法等。第四十三頁，共一百一十七頁。43

1.

氯化鈣轉(zhuǎn)化法：

在最適條件下培養(yǎng)大腸桿菌到對數(shù)生長期，收獲大腸桿菌并懸浮在CaCl2（50mmol/L）溶液中，置于低溫（0～5℃）環(huán)境下一段時間，鈣離子使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）。

感受態(tài)細(xì)胞可以懸浮于50%甘油中，-80℃保存6個月而不喪失活性。

第四十四頁，共一百一十七頁。44

在感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入質(zhì)粒DNA（重組的或非重組的），使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。冰浴1小時后，立即轉(zhuǎn)移至42℃熱休克90秒后，促進(jìn)受體細(xì)胞吸收DNA，馬上轉(zhuǎn)移到37℃水浴，并加入不含抗生素的培養(yǎng)基37℃振搖培養(yǎng)30～60分鐘，使質(zhì)粒DNA得到復(fù)制，并使抗生素的抗性基因得以表達(dá)。隨后，再將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種在含有抗生素的瓊脂平板上，過夜生長，從而得到轉(zhuǎn)化的菌落。第四十五頁，共一百一十七頁。45

在合適條件下，細(xì)菌約每20分鐘分裂一次，十個小時，瓊脂平板上便出現(xiàn)肉眼可見的菌落。每個菌落都是單一細(xì)菌的后代，所有細(xì)菌都具有相同的遺傳組成，稱為細(xì)菌的克隆（clone）。在一個克隆中，所有的細(xì)菌含有相同的外源DNA插入片段，如將這樣的一個菌落培養(yǎng)，生長出的菌落均含有相同的外源DNA序列，這一過程便是克隆化。應(yīng)用這一方法，可使某一特殊的重組DNA片段擴(kuò)增至數(shù)百萬個拷貝。第四十六頁，共一百一十七頁。46

粘粒帶有一個復(fù)制起點和一個藥物抗性標(biāo)志，粘性質(zhì)粒也能由標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌，并像普通質(zhì)粒一樣增殖。第四十七頁，共一百一十七頁。47

2.電穿孔法（electroporation）

也是一種將外源DNA導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的常用方法之一。將外源DNA與大腸桿菌混合于電穿孔杯中，在高頻電流的作用下，細(xì)胞壁出現(xiàn)許多小孔，使外源DNA能進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，無需制備感受態(tài)細(xì)胞。第四十八頁，共一百一十七頁。48電擊法第四十九頁，共一百一十七頁。49（二）感染（infection）

以λ噬菌體、粘粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，能主動感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。第五十頁，共一百一十七頁。50

為使λDNA重組體能夠感染大腸桿菌，必須在體外將λDNA重組體與λ頭部及尾部蛋白混合，使λDNA重組體被包入頭部蛋白外殼中，使之成為完整的噬菌體，才具有感染力。第五十一頁，共一百一十七頁。51

粘粒含有λDNA的cos區(qū)，也可用包裝λDNA相同的方法，體外包裝成λ噬菌體，再感染大腸桿菌。感染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)化效率。粘粒也可經(jīng)由轉(zhuǎn)化程序，將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，但其轉(zhuǎn)化效率非常低。第五十二頁，共一百一十七頁。52

（三）轉(zhuǎn)染（transfection）

由轉(zhuǎn)化和感染兩個詞構(gòu)成的新詞，指真核細(xì)胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。進(jìn)入細(xì)胞的DNA可以被整合至宿主細(xì)胞的基因組中，也可以在染色體外存在和表達(dá)。第五十三頁，共一百一十七頁。53（四）轉(zhuǎn)移重組體過程中的幾個問題

含目的基因的重組體能否有效地導(dǎo)入受體細(xì)胞，取決于是否選用合適的受體細(xì)胞、克隆載體和基因轉(zhuǎn)移方法。第五十四頁，共一百一十七頁。541．受體細(xì)胞克隆的受體細(xì)胞

從實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA(基因)并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞。原核生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞可以作為受體細(xì)胞，但不是所有細(xì)胞都可以作為受體細(xì)胞。第五十五頁，共一百一十七頁。55

原核生物細(xì)胞是一類很好的受體細(xì)胞，容易攝取外界的DNA，增殖快，基因組簡單，便于培養(yǎng)和基因操作。可用作cDNA文庫和基因組文庫的受體菌，用作建立生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物的工程菌，或者作為克隆載體的宿主。目前用作基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌，藍(lán)藻和農(nóng)桿菌等也被廣泛應(yīng)用。原核生物細(xì)胞受體細(xì)胞第五十六頁，共一百一十七頁。56

真核生物細(xì)胞受體細(xì)胞

酵母、某些動、植物的細(xì)胞。由于酵母的某些性狀類似原核生物，所以較早就被用作基因克隆受體。第五十七頁，共一百一十七頁。57

動物細(xì)胞也已被用作受體細(xì)胞采用生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞，由此培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因動物。體細(xì)胞可表達(dá)基因產(chǎn)物，并且最近通過體細(xì)胞培養(yǎng)出了多種克隆動物，可見動物體細(xì)胞同樣可以用作基因克隆的受體細(xì)胞。1）動物細(xì)胞受體細(xì)胞第五十八頁，共一百一十七頁。582）植物細(xì)胞受體細(xì)胞

優(yōu)于動物細(xì)胞的特點，一個活的離體體細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下比較容易再分化成植株，意味著一個獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)成能傳代的植株，成為轉(zhuǎn)基因植物。由于這個原因，近年來植物基因工程發(fā)展非常迅速。第五十九頁，共一百一十七頁。59

2．重組DNA分子導(dǎo)入原核生物細(xì)胞

大腸桿菌是用得最廣泛的基因克隆受體細(xì)胞，可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和三親本雜交等途徑，把重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。第六十頁，共一百一十七頁。60（1）轉(zhuǎn)化途徑（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)/感染途徑（3）重組DNA分子通過三親本雜交轉(zhuǎn)化大腸桿菌。第六十一頁，共一百一十七頁。61

當(dāng)重組DNA分子不能直接轉(zhuǎn)化受體菌時，可采用三親本雜交（triparentalmating）轉(zhuǎn)化法。被轉(zhuǎn)化的受體菌、含重組DNA分子的供體菌和含廣泛宿主輔助質(zhì)粒的輔助菌三者進(jìn)行共培養(yǎng)，在輔助質(zhì)粒的作用下，重組DNA分子被轉(zhuǎn)移到受體菌細(xì)胞內(nèi)，按照重組DNA分子攜帶的選擇標(biāo)記篩選克隆子。第六十二頁，共一百一十七頁。623．重組DNA分子導(dǎo)入真核生物細(xì)胞

真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，適用于原核生物基因轉(zhuǎn)移的方法不能有效地用于真核生物。因此，近年來經(jīng)過探索，發(fā)展了多種適用于植物和動物轉(zhuǎn)基因的方法。第六十三頁，共一百一十七頁。63（1）重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞用致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法

含Ti質(zhì)粒的致癌農(nóng)桿菌與一些植物細(xì)胞接觸后，Ti質(zhì)粒的一部分（T-DNA）可導(dǎo)入植物細(xì)胞，整合到植物基因DNA，隨其復(fù)制而復(fù)制。根據(jù)這一特性可構(gòu)建一系列Ti質(zhì)粒載體，與含目的基因的DNA片段重組，導(dǎo)入致癌農(nóng)桿菌，通過致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞。第六十四頁，共一百一十七頁。64其方法有：①葉盤轉(zhuǎn)化法：

將致癌農(nóng)桿菌接種在植物新產(chǎn)生的傷口，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。②原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法：

含Ti重組質(zhì)粒DNA致癌農(nóng)桿菌，同植物原生質(zhì)體進(jìn)行共培養(yǎng)，使重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。③

懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法：第六十五頁，共一百一十七頁。65

重組DNA的直接轉(zhuǎn)移法

為克服致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的受體局限性，近來發(fā)展了電穿孔法、微彈轟擊法、激光微束穿孔法、多聚物介導(dǎo)法和花粉管道法等，把重組DNA分子直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。采用的克隆載體不限于Ti質(zhì)粒載體。第六十六頁，共一百一十七頁。66

3.重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞

哺乳動物的細(xì)胞不易從周圍捕獲外源DNA，明顯地影響了哺乳動物轉(zhuǎn)基因的發(fā)展。近年來通過研究發(fā)展了一系列能有效地將外源DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法，主要有以下幾種：第六十七頁，共一百一十七頁。67

①病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法

由于病毒的種類繁多，用病毒DNA或RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)各異，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程各有不同。

主要有三種類型：其一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體DNA上；第六十八頁，共一百一十七頁。68

其二，帶有目的基因的病毒基因組是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞；其三，雖然帶有目的基因的病毒基因組是缺陷型的，但是被感染的受體細(xì)胞的基因組中已整合了病毒缺失的基因，所以沒有必要用輔助病毒混合感染。第六十九頁，共一百一十七頁。69

②用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法

哺乳動物細(xì)胞能捕獲粘附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。先將待轉(zhuǎn)染的重組DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，隨后逐滴緩慢地加入Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣沉淀，粘附在培養(yǎng)的細(xì)胞表面上，達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。第七十頁，共一百一十七頁。70

③DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法

DEAE-dextran(二乙胺乙基葡聚糖)是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞捕獲外源DNA分子?；静僮鳎浩湟?，先使病毒的DNA直接同DEAE-葡聚糖混合，形成DNA-DEAE-葡聚糖復(fù)合物，再處理受體細(xì)胞；其二，受體細(xì)胞先用DEAE-葡聚糖溶液預(yù)處理，隨后再同DNA接觸，也可達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。第七十一頁，共一百一十七頁。71

④聚陽離子-DMSO(二甲基亞砜)處理轉(zhuǎn)染法

用聚陽離子(polybrene)處理哺乳動物細(xì)胞，使細(xì)胞表面增加對外源DNA的吸附能力，再用25％～30％DMSO處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對DNA的捕獲量，達(dá)到有效的轉(zhuǎn)染。第七十二頁，共一百一十七頁。72

⑤脂質(zhì)體介導(dǎo)法

脂質(zhì)體(1iposome)是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，把用來轉(zhuǎn)染的DNA分子包在其中，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸，將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。第七十三頁，共一百一十七頁。73

包裝成脂質(zhì)體的SV40-DNA的轉(zhuǎn)染率比裸露的DNA的轉(zhuǎn)染率高出100倍。如先用PEG處理培養(yǎng)的受體細(xì)胞，使其易吸收培養(yǎng)基中的脂質(zhì)體，可提高轉(zhuǎn)染率10～20倍。在正常情況下，每個細(xì)胞平均可吸收1000個左右的脂質(zhì)體。這是哺乳動物轉(zhuǎn)基因研究中常用的方法之一。第七十四頁，共一百一十七頁。74

⑥顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)

鑒于哺乳動物細(xì)胞便于注射的特性，常應(yīng)用顯微注射法把外源DNA分子直接注入細(xì)胞。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量取決于注射的DNA分子。用pBR322/HSV-1tk重組DNA分子注射，轉(zhuǎn)化率不到0.1％，而用連接SV40-DNA某些序列的pBR322／HSV-1tk重組DNA注射，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)20％。第七十五頁，共一百一十七頁。75

為便于操作，也可采用“穿刺”法。處于細(xì)胞周圍的DNA隨微針穿刺形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞，或隨穿刺的針頭帶入細(xì)胞。⑦電穿孔法

其原理和操作過程類似植物細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)移DNA的方法。第七十六頁，共一百一十七頁。76五、篩選：

對工程菌/工程細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定篩選的目的①找到含目的基因克隆的菌落；②確定重組體的正確性。第七十七頁，共一百一十七頁。77

將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞以后，首要任務(wù)就是要篩選含有目的基因的轉(zhuǎn)化菌并加以擴(kuò)增。其步驟是：首先篩選出轉(zhuǎn)化菌；然后篩選出帶有重組體的克隆；最后是對DNA重組體進(jìn)行鑒定。第七十八頁，共一百一十七頁。78

鑒定的方法有多種：

①用克隆工具酶切，比較分析

②PCR擴(kuò)增

③必要時進(jìn)行DNA序列分析，以確定其大小，插入方向和堿基構(gòu)成正確。

所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。

第七十九頁，共一百一十七頁。79（一）遺傳學(xué)方法1．篩選轉(zhuǎn)化菌遺傳學(xué)選擇是鑒定一個數(shù)目龐大的細(xì)胞群體最為有效的方法，所有的克隆載體均帶有可供選擇的遺傳學(xué)標(biāo)志或特征，為遺傳學(xué)選擇帶來了方便。質(zhì)粒中含有針對某種抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化后，將細(xì)菌在含有這種抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌即被殺死，能生長的細(xì)菌就是已轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。本法又稱抗生素抗性轉(zhuǎn)入獲得法。第八十頁，共一百一十七頁。80

2．篩選帶有重組體的克隆

（1）插入滅活法（insertioninactivation）：

常被用于鑒別質(zhì)粒重組體和非重組體，適用于具有兩個或兩個以上抗生素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒。例如pBR322中有氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr），Tetr上有一個BamHⅠ位點，如將外源DNA通過BamHⅠ位點插入到Tetr基因的DNA序列中，使Tetr基因滅活。第八十一頁，共一百一十七頁。81pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第八十二頁，共一百一十七頁。82MCS有插入片段MCS無插入片段β-半乳糖苷酶X-Gal藍(lán)色LacZ基因MCS載體上有β-半乳糖苷酶N端編碼序列，細(xì)菌染色體DNA有β-半乳糖苷酶C端編碼序列（2）α-互補：“藍(lán)-白篩選”第八十三頁，共一百一十七頁。83（二）免疫學(xué)方法（目的基因產(chǎn)物檢測）

如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可以用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體，通過放射免疫、化學(xué)發(fā)光、顯色反應(yīng)進(jìn)行或免疫印跡試驗篩選。第八十四頁，共一百一十七頁。84（三）核酸雜交法對噬菌斑或菌落進(jìn)行原位分子雜交是從基因文庫、cDNA文庫或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達(dá)。第八十五頁，共一百一十七頁。8532P標(biāo)記的DNA分子探針雜交放射自顯影法DNA雜交直接鑒定第八十六頁，共一百一十七頁。86（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉(zhuǎn)移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析轉(zhuǎn)化子的分析—Southern雜交第八十七頁，共一百一十七頁。87

（四）PCR技術(shù)

PCR技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性，PCR技術(shù)對于鑒定陽性克隆十分有效，而且無須制備DNA。PCR獲得目的片段可以通過分子雜交和DNA測序進(jìn)一步鑒定。第八十八頁，共一百一十七頁。88（五）酶切鑒定

在轉(zhuǎn)化大腸桿菌并獲得了一系列菌落后，可用牙簽挑出單個菌落接種于2ml培養(yǎng)基中，37℃過夜生長。用小量快速提取質(zhì)粒DNA，選用1～2個限制酶分析，電泳后觀察有無插入片段、插入方向及與設(shè)計目的基因大小一致。這是最簡單的“篩克隆”鑒定方法。第八十九頁，共一百一十七頁。89（六）表達(dá)動物生物活性鑒定

依據(jù)目的基因產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行設(shè)計。提取、純化表達(dá)產(chǎn)物后，可選用依賴細(xì)胞株培養(yǎng)（如細(xì)胞因子IL-2等），對底物催化活性（酶）等進(jìn)行最后鑒定。第九十頁，共一百一十七頁。90

（七）DNA測序法

檢測目的基因有無發(fā)生突變并作鑒定。

（八）目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測

檢測目的基因在受體細(xì)胞中是否進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，提取總RNA，用雜交或RNA印跡法檢測。第九十一頁，共一百一十七頁。91六、表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物與下列因素有關(guān)：目的基因的特點，理化性質(zhì)和應(yīng)用要求表達(dá)載體的啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點的強(qiáng)弱基因拷貝數(shù)及在細(xì)胞中的狀態(tài)宿主細(xì)胞的穩(wěn)定性、翻譯效率表達(dá)的外源蛋白自身的穩(wěn)定性目的基因的表達(dá)是基因工程的最后一步，也是基因工程的目的。第九十二頁，共一百一十七頁。92（一）原核細(xì)胞表達(dá)體系主要利用細(xì)菌

表達(dá)外源蛋白原核表達(dá)體系主要以細(xì)菌作為宿主細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌、沙門氏菌、蘇云金桿菌等，其中又以大腸桿菌表達(dá)體系應(yīng)用最為廣泛和最成熟。原核表達(dá)體系既可用于原核基因表達(dá)，也可用于真核基因表達(dá)。第九十三頁，共一百一十七頁。93

大腸桿菌(Escherichiacoli)

遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高。不具備真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)，真核基因在大腸桿菌中會合成錯誤空間構(gòu)象的多肽鏈，易形成包涵體(無正確折疊的立體結(jié)構(gòu))無真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，如糖基化磷酸化修飾等第九十四頁，共一百一十七頁。94（1）將外源基因置于強(qiáng)啟動子和SD順序（核糖體結(jié)合位點）控制下；（2）刪除內(nèi)含子和5′非編碼區(qū)；（3）維持正確開放閱讀框架（ORF）；（4）mRNA穩(wěn)定且可被有效翻譯和折疊，形成的蛋白質(zhì)不被降解。

外源基因在原核表達(dá)體系中表達(dá)的必要條件：正常的轉(zhuǎn)錄與翻譯第九十五頁，共一百一十七頁。95原核表達(dá)體系有以下優(yōu)勢：①宿主菌遺傳背景和生理特性清楚，有多種工程菌株可供選擇②原核細(xì)胞繁殖能力強(qiáng)，操作簡便、省時③大規(guī)模發(fā)酵成本低，生產(chǎn)潛力大④表達(dá)水平一般較真核系統(tǒng)高，且下游工藝簡單、易于控制第九十六頁，共一百一十七頁。96原核表達(dá)系統(tǒng)的主要缺點：①原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞所特有的翻譯后加工修飾系統(tǒng)（如糖基化、磷酸化等），因此，針對這些需經(jīng)修飾的蛋白，無法用原核表達(dá)體系獲得有活性的產(chǎn)物。②目的基因不能是含有內(nèi)含子的DNA。③細(xì)菌本身產(chǎn)生的內(nèi)毒素等熱原不易去除干凈，為產(chǎn)品純化增加了難度。④蛋白的高水平表達(dá)常形成包涵體，提取和純化步驟繁瑣，而且蛋白復(fù)性較困難，容易出現(xiàn)肽鏈的錯誤折疊等問題。

第九十七頁，共一百一十七頁。97(二)真核細(xì)胞表達(dá)體系利用多種

真核細(xì)胞表達(dá)外源蛋白與原核表達(dá)體系相比，真核表達(dá)體系（特別是以哺乳類細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的表達(dá)體系）具有如下優(yōu)點：

①目的基因既可是基因組DNA，也可是cDNA，轉(zhuǎn)錄后能進(jìn)行加工。②目的基因的表達(dá)可受到更嚴(yán)格地調(diào)控，能對所表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工修飾，確保二硫鍵的精確形成，能正確進(jìn)行糖基化、磷酸化、寡聚體的形成等加工。③可使蛋白進(jìn)行分泌表達(dá)，從而有利于蛋白的分離純化④所表達(dá)的目的蛋白不易被降解，且對宿主細(xì)胞的影響較小。

第九十八頁，共一百一十七頁。98與原核表達(dá)體系相比，真核表達(dá)體系也存在諸多不足：

①宿主細(xì)胞繁殖速度慢，培養(yǎng)條件要求高②蛋白表達(dá)水平低③整個操作過程復(fù)雜、費時、成本高第九十九頁，共一百一十七頁。99常用的真核表達(dá)體系酵母表達(dá)體系昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系哺乳類細(xì)胞表達(dá)體系各種表達(dá)體系各有其優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行選擇本內(nèi)容詳見講義P43-46第一百頁，共一百一十七頁。100

第五節(jié)

基因工程研究的進(jìn)展及應(yīng)用

第一百零一頁，共一百一十七頁。101一、基因工程研究進(jìn)展

生物生命學(xué)科進(jìn)入重造、定向改造、創(chuàng)造生物遺傳性狀和物種的新時代。第一百零二頁，共一百一十七頁。102

包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒、粘粒（質(zhì)粒+噬菌體）、染色體及染色體與質(zhì)粒的整合系統(tǒng)，線粒體及葉綠體也有各自構(gòu)建的載體系統(tǒng)。

可以分別用于細(xì)菌、酵母、植物及動物的基因工程中。從應(yīng)用目的上分為通用克隆載體、大片段克隆載體，cDNA克隆載體及各種表達(dá)載體。目前正在發(fā)展真核生物強(qiáng)表達(dá)載體和基因定位整合的克隆載體。1.構(gòu)建了大量、不同類型的載體系統(tǒng)

第一百零三頁，共一百一十七頁。103

2.基因工程受體系統(tǒng)日趨全面

從早期大腸桿菌和酵母受體細(xì)胞，到各種真核生物（植物、動物）細(xì)胞系統(tǒng)。

現(xiàn)在正在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以動、植物個體作反應(yīng)器進(jìn)行目的基因的表達(dá)。對受體的優(yōu)化和選種，也是研究方向之一。第一百零四頁，共一百一十七頁。1043.基因組學(xué)研究中發(fā)揮重要作用

應(yīng)用基因工程技術(shù)及DNA測序技術(shù)，對人類、動物、植物和微生物的基因組進(jìn)行廣泛研究，取得突破性進(jìn)展。第一百零五頁，共一百一十七頁。105

4.基因工程含