染色體顯帶原理與技術

關于染色體顯帶原理與技術第1頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五一、染色體制備基礎知識（一）細胞及細胞周期（二）從DNA到染色體第2頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五（一）細胞周期及有絲分裂細胞：生物體結構和功能的基本單位，也是生命活動的基本單位。圖略。細胞周期：指由細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經(jīng)歷的過程。①G1期，指從有絲分裂完成到期DNA復制之前的間隙時間；②S期，指DNA復制的時期；③G2期，指DNA復制完成到有絲分裂開始之前的一段時間；④M期，細胞分裂開始到結束。G0期：間期細胞，細胞周期之外的細胞。第3頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五有絲分裂第4頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五（二）從DNA到染色體DNA螺線管超螺線管染色單體核小體壓縮7倍壓縮40倍壓縮6倍壓縮5倍共計壓縮8400倍第5頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五核小體nucleosome：

染色質(zhì)的基本結構第6頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五DNA分子的不同存在形式：

染色質(zhì)和染色體染色質(zhì)：間期細胞核中遺傳物質(zhì)的存在形式。染色體：分裂中期遺傳物質(zhì)的存在形式。一條染色體是一個DNA分子。第7頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五染色質(zhì)：

根據(jù)在分裂期和間期的染色不同，分為常染色質(zhì)：在間期核中分布較稀疏，淺染色，是轉錄活躍的DNA部分，一般位于核中央。在分裂期，位于染色體臂，深染色。含大量功能基因。異染色質(zhì)：是呈凝集狀態(tài)的DNA與組蛋白的復合物，由于螺旋化程度高，又稱為濃縮染色質(zhì)，一般位于核內(nèi)膜的邊緣形成一薄圈，即稱周圍染色質(zhì)。主要位于位于染色體的著絲粒、次縊痕、端粒等位置。間期和分裂期都深染色。基本無功能基因。第8頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五基本概念在細胞周期的有絲分裂中期，染色體的形態(tài)結構比較穩(wěn)定，一般所描述的染色體的形態(tài)結構都是中期染色體。染色體組型：又稱核型Karyotype，是指將動物、植物、真菌等的某一個體或某一分類群（亞種、種、屬等）的體細胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對恒定的特征排列起來的圖像。核型模式圖Idiogram：是指將一個染色體組的全部染色體逐個按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。第9頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五二、染色體顯帶技術第10頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五Q帶：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗帶（富含AT的明帶，富含GC的暗帶）；G帶：Giemsa染料染色后所呈現(xiàn)的染色體區(qū)帶；（AT區(qū)是深色）R帶：是中期染色體經(jīng)堿性磷酸鹽處理，丫啶橙或Giemsa染色后所呈現(xiàn)的帶型，一般與G帶正好相反；C帶：顯示著絲粒結構異染色質(zhì)及其它染色體區(qū)段的異染色質(zhì)。T帶：是染色體端粒部位經(jīng)丫啶橙染色后呈現(xiàn)的區(qū)帶；N帶：Ag-As染色，主要染核仁組織者區(qū)域的酸性蛋白。

1975年建立了染色體高分辨顯帶技術。

第11頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五幾種顯帶的制作方法之間的關系第12頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五G顯帶實驗原理

基礎G顯帶：制備的染色體標本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋——帶，表明每條染色體的特征。

只有可以分裂的活細胞，才能制備染色體。實驗材料：人外周血淋巴細胞，植物血凝素（PHA）刺激血中的淋巴細胞轉化成淋巴母細胞，使其恢復增殖能力。使用秋水仙素或者秋水仙堿破壞紡錘絲的形成，將細胞阻留在有絲分裂中期。從而獲得大量的細胞中期分裂相供染色體分析。--采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至72小時細胞進入增殖旺盛期，此時加入秋水仙素抑制細胞分裂，使細胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細胞。細胞低滲技術使細胞中的染色體在玻片上鋪散得更好，易于計數(shù)和觀察。甲醇/冰醋酸固定液快速殺死和固定細胞。第13頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五染色體檢查過程（G顯帶）培養(yǎng)細胞；秋水仙素處理；抑制中期分裂相低滲；使細胞膨脹固定；染色體形態(tài)固定滴片；分散染色體。冰片法，熏蒸法。顯帶和染色；顯微鏡下分析。第14頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗步驟1.采血及接種培養(yǎng)1.1采血：滅菌注射器抽取外周靜脈血3~5ml(綠帽肝素抗凝管）1.2接種

在超凈工作臺中，注射器滴加25滴全血（6號針頭）至外周血淋巴細胞培養(yǎng)液中（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清），水平搖動混勻。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68~72小時。1.3終止培養(yǎng)前35~40min，加入秋水仙素，使終濃度達到0.5μg/ml。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)。秋水仙素主要作用在于能阻滯微管(紡錘絲)形成，或使已形成的微管解聚，從而使染色體停留在中期。秋水仙素濃度大，則處理時間短，如濃度小，則處理時間長。但若秋水仙素加入過量，或處理時間過長，分裂細胞多，染色體凝集和收縮變小，或發(fā)生異常分裂現(xiàn)象，甚至染色體破碎，不宜用于觀察染色體的形態(tài)及計數(shù)；秋水仙素加入太少，或處理時間偏短，染色體形態(tài)偏長或無中期分裂相。第15頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五2．制片2.1收集細胞：將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中，2000rpm離心5分鐘2.2低滲：棄上清液，加入37℃預溫的

0.075mol/LKCl溶液8ml，用吸管輕輕吹打細胞團混勻后，置37℃恒溫水浴箱低滲處理20~25分鐘。2.3預固定：加入

1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1）或清質(zhì)劑300ul，用吸管小心吹打、混勻，2000rpm離心5分鐘。2.5固定：第一次：棄上清液，加入3ml固定劑，吹打細胞團制成細胞懸液后，室溫下固定15分鐘，2000rpm離心5分鐘。第二次：棄上清液，重復固定一次。第三次：

棄上清液，根據(jù)細胞數(shù)量的多少適當加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細胞制成懸液。2.6滴片：

吸取少量細胞懸液，滴2～3滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散，水蒸氣熏蒸，70℃2小時烤片，待染色。第16頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五3.G顯帶3.1取2.5％胰酶溶液0.5ml，加入50ml生理鹽水染色缸中（終濃度0.025%），用

1NHCl或1NNaOH調(diào)節(jié)PH7.0左右，置

37OC預溫。

3.2將烤好的玻片標本放入胰酶溶液中處理60秒鐘左右（胰酶消化時間需不斷調(diào)試，摸索。不同時間配制，不同批號胰酶，以及隨著處理標本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時間都會變化）3.3取出染色體玻片標本，置于37℃預溫的生理鹽水中，終止胰酶的作用。3.4將玻片標本放入37℃預溫的1：10稀釋的Giemsa染液中，染色5～10分鐘。3.5自來水沖洗，自然晾干。第17頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五第18頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五G顯帶常見問題及處理：培養(yǎng)細胞:細菌污染。霉菌污染。細胞收獲量小。玻片上細胞間期核稀疏。秋水仙素：大量染色體太細長，纏成毛線團樣。分裂相很多，但染色體短小，分叉。幾乎沒有分裂相。低滲：太分散。不分散。固定：太發(fā)毛。背景不干凈。有大團塊深染色物質(zhì)。滴片；不分散。太分散。顯帶和染色；沒有條帶。條帶模糊。一個分裂相內(nèi)，有的染色體有條帶，有的沒有。有的胰蛋白酶消化太過，有的分裂相則不足。Giemsa染不上色。染色太深。染色太淺。第19頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五各種組織標本的染色體制作不同的標本，不同的檢查目的，需要調(diào)整染色體的制作過程。處理原則：使盡可能多的細胞進入細胞周期，旺盛生長，大量分裂，防止污染。第20頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五外周血：5%小牛血清RPMI-1640，+PHA。檢查體細胞核型。骨髓：10%小牛血清RPMI-1640，不含PHA。檢查腫瘤細胞核型。羊水：標本珍貴。專用羊水培養(yǎng)基，防止母體細胞污染。檢查胎兒細胞核型。絨毛組織：…同上。細胞為細胞團（組織），防止細菌污染。清洗、剪碎后消化成單細胞或者細胞團培養(yǎng)。檢查胎兒核型。臍帶血：血液細胞，性質(zhì)同外周血。一定注意防止母體污染！檢查胎兒核型?；顧z組織：如實體瘤標本。細胞系：永生細胞。直接常規(guī)制作染色體標本即可。第21頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五C顯帶

將染色體用堿或者去垢劑處理后，再用Giemsa染色，可以得到只顯示著絲粒區(qū)域的帶紋，稱為C—帶。第22頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗原理

C顯帶技術由Arrighi和Hsu于1971年發(fā)明，是顯帶技術中最簡單的一種帶型。其方法的本身是起源于原位雜交。Arrighi和Hsu發(fā)現(xiàn)用堿處理載玻片上的染色體使DNA變性之后，再在SSC溶液中、65℃的條件下使其復性，在受控制的條件下經(jīng)Giemsa染色可顯示出在染色體的一定部位是深染的。70年代用原位雜交的方法證明深染的區(qū)域（C帶區(qū)）是結構異染色質(zhì)的區(qū)域，也就是一般而言的DNA高度重復序列的區(qū)域。然而，現(xiàn)在更為流行的看法認為氫氧化鋇或其它堿性物質(zhì)的處理是優(yōu)先提取了非C帶區(qū)的DNA，SSC的處理有助于帶型的清晰。第23頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗用品

光學顯微鏡，恒溫水浴箱，培養(yǎng)皿，小鑷子，未染色的染色體標本片（片齡一周內(nèi)），5%氫氧化鋇水溶液，2×SSC液，0.2mol/LHCl，PBS，吉姆薩染液。第24頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗方法1、制片：常規(guī)外周血法制備的標本。2、HCl處理：取5-7天標本齡的染色體標本，選擇染色體分散好的標本在0.2mol/LHCl中室溫下處理10分鐘-1小時，然后用自來（蒸餾）水沖洗干凈。這一處理是使DNA脫嘌呤，但沒有DNA骨架的斷裂。（此步也可省略）3、氫氧化鋇處理：將標本浸入60-65℃的5%（飽和）氫氧化鋇液中，10秒至幾分鐘（隨標本齡而變動，常規(guī)：1-4分鐘；1月齡片：8-16分鐘，最好設置梯度），堿性處理可能通過產(chǎn)生一個高水平的DNA變性，促進DNA溶解。第25頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五4、2×SSC處理：在60-65℃的2×SSC液中處理90分鐘時，用自來水沖洗干凈，2×SSC溫育可使DNA骨架斷裂并使斷片溶解。5、染色：用蒸餾水配制5%Giemsa，染色5-10分鐘，用自來水沖洗干凈，室溫下風干后即可鏡檢。6、鏡檢：用顯微鏡高倍鏡鏡下檢查顯帶標本，如著絲粒區(qū)域或異染色質(zhì)部位（1,9,16號染色體次縊痕）及Y染色體長臂q12深染，染色體其它部位染色淺，即為可取標本。若觀察到染色體均呈白色，那么，可能是堿處理或2×SSC溫育過度。第26頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

顯帶觀察

嚴格地講，C帶顯示的是緊鄰著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)?？梢?，在人體染色體C帶標本中，深染的有：1、絕大多數(shù)染色體的著絲粒區(qū)；2、第1，9和16號染色體的次縊痕；3、Y染色體長臂的遠側端。第27頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

巴黎會議（1971）對各條染色體的C帶描述如下:

1號大，從著絲粒擴展到q。

2號小。

3-8號中等

9號大，從著絲粒擴展到q。

10號中等。11號中等，但比10號或12號大些。

12號中等。

13號中等，有時分為二節(jié)。

14號-15號中等。

16號大，從著絲粒向q擴展。第28頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五17號中等。

18號中等，但比17號大些。

19-22號中等。

X中等

Y在著絲粒處有一條非常窄的帶；q的末端有一寬帶。1，9，16號的C帶和Yq上的寬闊的遠側帶都有明顯的形態(tài)變異及異態(tài)性。第29頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五第30頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五第31頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五R顯帶

原理：

在細胞的培養(yǎng)過程中加入堿基的類似物，然后用紫外線照射后再用Giemsa染料染色，可以得到和G—顯帶相反的帶紋，稱為R—帶。即G顯帶的深帶變?yōu)闇\帶，淺帶染成深帶。當G顯帶顯示的染色體兩臂末端為淺帶時，如果兩臂末端發(fā)生缺失等異常，一般難以發(fā)現(xiàn)和識別，而R帶正好能將此處顯示出易于識別的深帶。所以，R顯帶技術有利于檢測染色體的末端缺失、重排等。第32頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五光學顯微鏡、恒溫水浴箱、紫外燈、培養(yǎng)皿、常規(guī)制片材料、BrdU、秋水仙素、2×SSC溶液（0.3mol/LNaCl+0.03mol/L檸檬酸鈉）、Gimesa染液等。實驗用品第33頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗方法

1.常規(guī)培養(yǎng)細胞，終止前10小時在培養(yǎng)基中加BrdU（使其終濃度為12μg/ml）。2.繼續(xù)培養(yǎng)6小時后加秋水仙素20μg/ml的3滴（7號針頭垂直豎滴，使終濃度為0.04-0.08μg/ml）。3.常規(guī)收獲、處理細胞，制片。4.在60℃恒溫水浴箱中，置一培養(yǎng)皿于水面上（皿內(nèi)加1/32×SSC溶液，將所制玻片浸泡在內(nèi)）。距玻片10cm處放置一20瓦紫外燈，照射玻片30-45分鐘。5.待紫外處理時間結束后，用自來水沖凈。6.Gimesa染色5分鐘，自來水沖凈，室溫干燥后于鏡下觀察。第34頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

注意：

1.Brdu的濃度和作用時間是實驗成敗的關鍵。

2.紫外燈照射距離玻片太遠也不利于帶型的顯示。

3.若為女性標本，還可見淡染的遲復制X。第35頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五顯帶觀察

各號染色體顯現(xiàn)的帶紋與G顯帶相反，在G帶染色體標本出現(xiàn)的深帶用R顯帶法就是淺帶，同時在G顯帶染色體標本出現(xiàn)的淺帶用R顯帶法就是深帶。與G顯帶的對比圖：第36頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五R顯帶總體圖第37頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五第38頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五G11技術G11式顯帶是一種特異性顯示9號染色體次縊痕的顯帶方法，一般用于9號染色體次縊痕多態(tài)分析、家系調(diào)查，親子鑒定等研究以及9號染色體倒位的細胞遺傳學分析。第39頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗用品

光學顯微鏡、恒溫水浴箱、染色缸、自制新鮮染色體玻片、吸管、計時器、pH試紙、蒸餾水、0.1N氫氧化鈉、Gimesa染液等。第40頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗方法3mlGimesa原液中加入蒸餾水47ml，混勻，用氫氧化鈉調(diào)pH至11。將染色體玻片放入其中染色5分鐘左右。自來水沖洗，干燥。觀察可見9號染色體次縊痕染成紫紅色，其它染色體長短臂均顯示藍色。第41頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五注意事項：1、染色體玻片片齡一般不要超過一周，且在顯帶之前最好再次75℃烤片5分鐘。2、pH值為11是顯帶成功的關鍵。3、染色時間可先摸索，如整個背景為藍色、次縊痕未出現(xiàn)，可相應地延長染色時間；如整個背景為紫紅色、次縊痕不明顯則可相應地縮短染色時間。第42頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五顯帶觀察：9號長臂次縊痕顯紫色

第43頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

Q顯帶

70年代初期，瑞典的化學家Caspersson首先用熒光染料喹丫因氮芥(QuinacrineMustard)處理染色體標本，發(fā)現(xiàn)在熒光顯微鏡下每條染色體出現(xiàn)了寬窄和亮度不同的輝紋，即熒光帶，而各條染色體有其獨特的帶，由此可以清楚地鑒別人類的每一條染色體，稱為Q—帶。第44頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗原理

染色體用一種易結合于富含AT的DNA的熒光染料染色，如quinacrine，DAPI或Hoechst33258，通過UV熒光顯微鏡可以觀察染色體顯示亮度不同的帶紋，Q顯帶的帶紋與G顯帶的非常相似，亮帶相當于G顯帶的深帶，暗帶相當于G顯帶的淺帶。第45頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗用品

光學顯微鏡、恒溫水浴箱、立式染色缸、人外周血淋巴細胞染色體玻片標本（75℃中烤片3小時，未經(jīng)染色）。pH6.0緩沖液，Soresens緩沖液(pH6.0)、pH6.0的磷酸緩沖液。第46頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗方法

將標本置于pH6.0緩沖液中浸5～10分鐘后，再轉浸入用Soresens緩沖液(pH6.0)配制的0.2%的喹吖因、阿的平染液中染色5～10

分鐘，用pH6.0的磷酸緩沖液漂洗2次，每次

5分鐘，于玻片上滴加1～2滴新鮮緩沖液，加蓋片，在熒光顯微鏡下觀察。第47頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五Caspersson等（1971）的方法：

取用空氣干燥標本的玻片→浸入95%、70%、50%的乙醇和蒸餾水使其吸水→浸入pH7的檸檬酸/磷酸鹽緩沖液中→用預溫至20℃芥子喹吖因（50ug/ml）染液染色20分鐘→在上述緩沖液中漂洗三次，每次5分種→然后用緩沖液蓋片封存→在熒光顯微鏡下觀察。第48頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五顯帶觀察

帶型與G顯帶標本一致，熒光顯微鏡下觀察染色體上呈現(xiàn)出的亮帶就相當于G顯帶染色體標本的深帶。

1號染色體：

短臂由遠端的弱熒光節(jié)段逐漸過渡到一中等熒光節(jié)端，后者可分為兩條帶。長臂有5條中等熒光帶，中央一條最明顯，次縊痕的熒光陰性。第49頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五第50頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五Ｎ顯帶

此技術可以使13、14、15、21和22號染色體的隨體和隨體柄著色。

第51頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

實驗原理

人類的近端著絲粒染色體(即13、14、15、21和22號染色體)的副縊痕處與核仁形成有關，故稱核仁形成區(qū)（nucleolus-organizingregion，NOR），它是中期染色體上的明顯結構之一。應用DNA-RNA分子雜交技術,證明人類的18S和28S核糖體RNA(rRNA編碼結構)的基因(rDNA)位于NOR。目前已有多種技術可以顯示中期染色體上的核仁形成區(qū)。第52頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

其中最簡單而又準確的方法是銀染法,即利用硝酸銀將具有轉錄活性的核仁形成區(qū)(rRNA基因)特異性地染成黑色,人們將這種銀染陽性的核仁形成區(qū)稱為Ag-NOR,它們是具有轉錄活性的18SrRNA基因和28SrRNA基因所在的部位。由于具有轉錄活性的rRNA基因(rDNA)往往伴有豐富的酸性蛋白質(zhì),該類蛋白質(zhì)含有巰基（-SH）和二硫鍵（-S-S-）,能使AgNO3中的Ag+還原成Ag顆粒,因此有轉錄活性的核仁形成區(qū)常被鍍上銀顆粒而呈現(xiàn)黑色,沒有轉錄活性的NOR則不著色。故其著色程度與細胞中rRNA基因的轉錄活性相一致。在同一物種，Ag-NOR的數(shù)目以及它們在染色體上的位置是相對恒定的，如果發(fā)生了改變就意味著rRNA基因的活性發(fā)生了變化，故此項技術是目前探討rRNA基因功能的方法之一第53頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

此外，人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合，這種聯(lián)合可能是造成近端著絲粒染色體不分離、斷裂和易位的原因。利用銀染技術可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到有銀染物質(zhì)相連。因此，銀染近端著絲染色體聯(lián)合（Ag-stainedacrocentricassociation,Ag-AA）可以作為準確地判斷人體細胞是否存在近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合的客觀標準。目前，也將Ag-AA看作反映rRNA基因活性大小的一個指標。所以銀染技術已逐漸受到重視，并已開始廣泛應用于腫瘤細胞遺傳學、體細胞遺傳學、進化遺傳學、臨床細胞遺傳學及藥物、化學因素等的遺傳效應的研究上。第54頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗用品光學顯微鏡、恒溫水浴箱、移液槍、培養(yǎng)皿（干燥）、吸管、擦鏡紙、小鑷子、未染色的染色體標本片（片齡一周以內(nèi)）、硝酸銀、甲酸、Giemsa染液、一次性離心管（15ml）、去離子水、錫箔紙等。第55頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗方法1、設一60℃水浴箱；另置Giemsa染液缸于37℃水浴箱。2、臨時配制新鮮的AgNO3溶液：取一次性離心管（15ml）一支，稱取AgNO35g溶于10ml去離子水中，加10ul甲酸，混勻。將一干燥培養(yǎng)皿漂于60℃水浴箱水面上。3、將玻片用4層干凈擦鏡紙（略小于玻片大?。┥w好。4、用吸管將AgNO3溶液慢慢滴于玻片紙上，直至擦鏡紙呈棕黃色（黑色）為止，一般5ml能滴兩張玻片。5、擦鏡紙變黑后，用鑷子輕輕啟開擦鏡紙，（將玻片）用自來水沖干凈。第56頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五6、Giemsa染色：吉姆薩母液用蒸餾水按一定的比例稀釋。例如，10份蒸餾水加1份吉姆薩母液稀釋即為10：1。一般染色5分鐘。

7、染色后的玻片標本用自來水洗去多余染料，染色過深可用磷酸緩沖液脫色。室溫下風干后即可鏡檢，必要時可用樹膠封片。鏡檢時先在低倍鏡下選擇分散好、長度適中的分裂相，然后轉換油鏡觀察其顯帶的情況，選擇顯帶好的標本進行核型分析。第57頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

注意事項：

1、AgNO3工作液應現(xiàn)用現(xiàn)配，并注意避光。用錫箔紙包住離心管，放置時間不能超過20分鐘，如放置的時間較長，溶液出現(xiàn)混濁即不宜再使用。2、滴AgNO3液時，不能讓玻片干燥。注意防止銀染液濺至衣物和手上，以免留下難以去除的黑色污點。3、滴片時染色體標本片一定要平置，以使染液均勻分布在標本上，使標本著色均勻。4、一定要讓玻片擦鏡紙變黑后再沖洗。5、染色時間因材料而異，因吉姆薩染料批號不同、質(zhì)量上有差異，因此其染色液濃度和染色時間需作適當調(diào)整。第58頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五顯帶觀察13、14、15、21和22號染色體的隨體和隨體柄為黑色。第59頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五第60頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五第61頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五T顯帶T顯帶是R顯帶的亞類，因為特異地著色在端粒而稱為T顯帶。T帶是R帶的最深染部分，必須用特殊的高熱處理染色體，然后用吉姆薩或與熒光聯(lián)合染色。但使用得不多，所以在此只是作簡單介紹。第62頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗原理

端粒是維持染色體正常復制和上下代傳遞的三個基本功能單位之一。它的功能包括確保染色體末端的正常復制；防止斷裂的DNA與染色體末端的重組。它們亦是哺乳動物生殖細胞減數(shù)分裂第一次分裂時同源染色體配對的起始部位。每次細胞分裂，染色體丟失其末端的約100核苷酸，此變短的端?？蔀榧毎峁┮挥薪z分裂的時鐘。丟失的端粒序列可經(jīng)端粒酶的作用逐個加回。T顯帶技術專門顯示染色體端粒，可用于分析染色體端粒有無缺失、易位等畸變。T顯帶是R顯帶的亞類，因為特別地著色在端粒而稱為T顯帶。T帶是R帶的最深染部分，必須用特殊的高熱處理染色體，然后用吉姆薩或與熒光聯(lián)合染色。第63頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五實驗用品

光學顯微鏡、恒溫水浴箱、培養(yǎng)皿、1ml

注射器、擦鏡紙、小鑷子、未染色的染色體標本片（片齡一周以內(nèi)）、磷酸鹽緩沖液（pH6.7）、吉姆薩染液（pH5.1）、吖啶橙染料。第64頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

實驗方法

制片：常規(guī)外周血法制備的標本。把染色體玻片標本放在含吉姆薩的pH6.7磷酸鹽緩沖液中，加熱至87℃。染色：用吖啶橙染料染色，或者經(jīng)同樣熱變性后用吉姆薩染液染色5分鐘。鏡檢：用顯微鏡高倍目鏡下檢查顯帶標本，如染色體末端出現(xiàn)一定的帶型，稱端帶型（T帶），即為可取標本。第65頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五顯帶觀察1、4、11和19號染色體短臂的末端顯出綠色T帶，以8、9、10和17號染色體長臂的端帶最為鮮明，5、12、14、16、20、21和22號染色體末端也稍顯綠色，3、6、18、X和Y染色體不顯端帶。熱處理如持續(xù)15~25分鐘。11號染色體長臂近側段和19號染色體短臂近側段，以及22號染色體長臂近側段均顯示典型的中間綠帶。此法特別用于識別22號染色體的長臂。熱處理30分鐘或更長時間，就會出現(xiàn)R帶型。第66頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五性染色質(zhì)檢測技術

X小體檢測技術Y小體檢測技術第67頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五X小體檢測技術X小體：在間期細胞核中，由于女性的兩條X染色體中的一條基本處于失活狀態(tài)而形成一種特殊的深染的塊狀結構，稱為X小體。X小體與X染色體的關系

用人體的體細胞，如口腔上皮細胞或女性個體的陰道上皮細胞，通過特異的處理和染色，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)部分細胞核膜的內(nèi)緣有一塊染色較深、大小為1μm左右的呈半月形的小塊，即X小體。有些細胞中，X小體的位置不在核膜的內(nèi)緣，那就不容易與其他的染色質(zhì)塊區(qū)別了，所以一般只用緊貼于核膜內(nèi)緣的作為陽性。第68頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五

根據(jù)有關實驗查明一個分裂間期細胞核中僅有一條X染色體呈松散狀態(tài)，參加細胞生理活動，另一條X染色體則仍保持異固縮的狀態(tài)，所以染色較深而成為X小體。據(jù)此，正常男性個體不可能出現(xiàn)X小體；正常女性可能出現(xiàn)一個X小體。其X小體與X染色體的關系如下表，即X小體數(shù)目等于X染色體數(shù)目減1。第69頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五性染色體的類型性別X小體的數(shù)目XYXOXXXXYXXXXXXX男女女男女女001123第70頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五口腔粘膜細胞X小體檢測法

1、漱口3次，然后以木質(zhì)壓舌板刮取口腔頰部粘膜細胞，放入盛有生理鹽水的離心管中，搖動分散細胞。

2、用1000轉/分離心10分鐘，除去上清液，細胞沉淀物用3∶1的甲醇冰醋酸固定劑固定10分鐘。

3、再用1000轉/分離心10分鐘，除去上清夜，向細胞沉淀物中加入幾滴新的3:1的甲醇冰醋酸固定劑制成細胞懸液。4、將細胞懸液滴入載玻片上，讓其在空氣中干燥后，放入5NHCl中處理10分鐘，自來水中漂洗數(shù)秒鐘，放入0.2%甲苯胺藍染色液中染色1~1.5分鐘或放入硫堇染色液中染色30分鐘，自來水漂洗，空氣中干燥后，在油鏡下依次觀察細胞核著色均質(zhì)，核摸完整的細胞100個，并計數(shù)具靠近核膜邊緣的半月形X小體的細胞數(shù)第71頁，共80頁，2022年，5月20日，1點32分，星期五羊水細胞X小體檢測法

從中期妊娠（16周左右）的孕婦中，經(jīng)羊膜穿刺抽取羊水5~10ml左右，放入離心管中，以1000轉/分離心10分鐘，去上清液，加入3:1甲醇冰醋酸固定劑5~10ml,固定30分鐘以后；再以1000轉/分離心10分鐘，去上清液，再加入新鮮的固定劑3~5滴制成細胞懸液；然后按口腔粘膜細胞X小體檢測法制片，染色和讀片。若抽取的羊水呈乳白